孕酮对吗啡条件性位置偏爱大鼠相关脑区中枢多巴胺D2受体水平的影响

于动震，侯艳宁

单胺类神经递质同样是与阿片类物质依赖有密切关系的一种重要的神经递质，包括儿茶酚胺和吲哚胺等，前者主要指去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)和多巴胺(dopamine，DA)，后者主要指 5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)。单胺类神经递质在中枢神经系统中参与脑缺血、镇痛以及学习记忆等多种病理生理过程。另外，该类神经活性物质在吗啡依赖的形成和复吸过程中也具有重要的作用，而且DA是动机活动和产生欣快感的重要神经递质，对情绪、学习记忆和运动等的调节至关重要［1］。DA发挥上述生理作用，必须通过与其受体结合才能实现。多巴胺受体属于G蛋白偶联受体，都是由大约400个氨基酸构成，分子质量在50 000 u左右。氨基酸链在细胞外为N-末端，细胞内为C-末端，所有亚型受体都穿透膜。根据细胞内信号转导过程的差异，即其结构特性及其对腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)的不同调节作用，主要分为DⅠ型和DⅡ型两类受体。DⅠ型受体包括D1和D5受体，DⅡ型受体包括D3、D4和D5受体。D1受体参与吗啡引起的运动增强效应，其拮抗剂可以减少吗啡成瘾大鼠对环境刺激的反应，即降低了该大鼠感受欣快的效应，增加了大鼠觅药动机，又抑制了该大鼠的行为活动［2］。在药物依赖的作用中，与D1受体相比，D2受体的作用似乎更加突出。行为实验证明，D2受体激动剂可产生精神兴奋剂样的行为效应，增强运动性活动、定型行为及其他强化反应，并降低伏隔核内脑啡肽前体mRNA的生成量［3］。D2拮抗剂明显阻滞动物自身给药的奖赏效应和减弱条件性位置偏爱［4－5］。中脑边缘多巴胺系统(meolimbic dopamine system，MLDS)是公认的与成瘾有关的重要脑区［6］，在药物的反复作用下MLDS内相关核团或神经元突触发生持续的对抗性适应，特别是DA受体会发生一系列适应性变化，涉及到受体的数量或活性、细胞内信号转导分子活性或信号转导途径，以及进一步的基因表达等的改变，这些适应性变化构成了药物依赖的神经生物化学基础［6－7］。有研究表明，伏隔核内多巴胺神经元直接参与阿片的急性奖赏效应及负性强化作用［8］。

目前，关于吗啡精神依赖对脑内神经甾体水平影响报道较多，而对外源性神经甾体影响吗啡精神依赖及其机制研究的相关报道较少。本实验室前期研究表明［9－11］，孕酮可以有效的抑制大鼠吗啡条件性位置偏爱的获得，并且中枢单胺类神经递质水平的变化在孕酮逆转吗啡CPP过程中发挥了重要的作用，但是DA受体在孕酮逆转大鼠吗啡位置偏爱时是否发生了变化在国内外尚未见报道，为了解决这一问题，本实验采用了免疫组织化学(immunohistochemistry)方法，研究了吗啡CPP时，大鼠伏隔核(nucleus accumbens，NA)、腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)及纹状体(striatum，ST)内 D2 受体水平的变化，最终探讨了单独使用孕酮训练或与吗啡合用时，对大鼠伏隔核、腹侧被盖区及纹状体内D2受体水平的影响，进一步深入探讨神经甾体孕酮抑制吗啡CPP效应的中枢单胺受体机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 ♂ Sprague Dawley(SD)大鼠32只，实验开始时体质量170～180 g，河北省实验动物中心提供(清洁 Ⅱ级，合格证号:603216)。将大鼠随机分为4组，分别为空白对照(C)组、吗啡(Mor)组、孕酮(PROG)组和孕酮加吗啡(PROG+Mor)组，每组动物8只。动物适应新环境5 d后再进行实验，水和食物自由获得。

1.2 药品和试剂 孕酮购自美国Sigma公司，溶于10%的2-羟丙基-β-环糊精中，配成浓度为5 g·L－1的孕酮溶液;盐酸吗啡注射液购自沈阳第一制药厂，溶于生理盐水中，配成浓度为2.5 g·L－1的溶液;兔抗鼠多巴胺 D2受体，购于 Chemicon公司。二抗SP-9001系列工作液试剂盒(包括A:内源性过氧化酶阻断剂，B:封闭用正常山羊血清，C:生物素标记羊抗兔IgG，D:辣根酶标记链酶卵白素工作液)及抗体稀释液购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 Dig Behv动物行为分析系统和位置偏爱视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司);A0392脱水机、HISTOECENTR包埋机、AS325R切片机(英国Thermo公司);PHY-Ⅱ病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器厂);YWY781B医用微波仪(浙江临安电子器材厂);DH64电热恒温干燥箱(上海市跃进医疗器械一厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 CPP的建立 参考文献方法［4］略做修改。训练前先分析大鼠在训练箱的黑室和白室的累积停留时间，测定大鼠的自然位置偏爱，在本实验条件下为黑室。以非位置偏爱侧即训练箱的白室为伴药侧，训练时用隔板封闭黑白两室的通道，大鼠每天训练2次，上午(8:00)注射后放入白室，下午(14:00)注射后放入黑室，大鼠每次在箱内均停留45 min，两次间隔6 h。Mor和PROG+Mor组大鼠上午腹腔注射吗啡5 mg·kg－1，给予吗啡的前10 min分别给予皮下注射10%的2-羟丙基-β-环糊精和PROG均为15 mg·kg－1，下午均注射等量的生理盐水和10%的2-羟丙基-β-环糊精，连续训练10 d。最后1次训练后24 h进行CPP测试，测试时将隔板倒置，使大鼠可以在黑白箱中自由出入，记录在不给药状态下10 min内大鼠的活动情况，并软件分析大鼠在白室的累积停留时间。

1.4.2 样品的处理 CPP测试结束后，将SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉(2%，W/V，0.3 ml/100 g体质量)，开胸，以30℃的生理盐水(50～100 ml/250～350 g)经左心室灌流，然后以4%多聚甲醛200 ml灌流固定，总时间大于30 min。开颅，取出整个大脑，去除小脑，置4%多聚甲醛60 ml于4℃后固定，石蜡包埋，进行连续冠状切片，切片厚3 μm，隔二取一，每只大鼠每个脑区做6套切片，置干燥箱烘干备用。

1.4.3 D2受体ABC法免疫细胞化学染色 取出标本，过氧化氢室温孵育5 min;正常羊血清封闭非特异性抗原;倾去血清，滴加一抗工作液(1∶100稀释)室温湿盒中放置1 h后置4℃冰箱过夜;滴加生物素标记的二抗工作液，室温湿盒中放置75 min;滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液;DAB显色，苏木精复染10 min，自来水冲洗;体积分数为1%盐酸乙醇分色;1%氨水中和;常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 统计学分析 采用Image-Pro Plus 5.1分析软件测定D2受体表达的平均光密度(MOD)，结果以±s表示，每张片子随机选5个视野，取均值作为此样本的MOD值，数据采用SPSS 17.0软件，各组间采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，继于LSD检验。

2 结果

2.1 孕酮对吗啡CPP效应获得的影响 5 mg·kg－1吗啡训练10 d后，吗啡组在伴药侧的停留时间明显长于本组训练前及空白对照组，分别延长了40.24%和36.99%(P＜0.01)。单独给予15 mg·kg－1孕酮训练10 d，大鼠在伴药侧的停留时间与本组训练前及空白对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。在给予吗啡的前10 min给予15 mg·kg－1孕酮，大鼠在伴药侧的停留时间与训练前及空白对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)，与吗啡组比较缩短22.78%(P＜0.01)。结果见Tab 1。

2.2 D2受体在正常♂大鼠部分脑区内的分布 在空白对照组大鼠各个脑区中，可以发现D2受体在腹侧被盖区、纹状体和伏隔核中均有表达，但以纹状体和伏隔核中的表达密度较高，而腹侧被盖区的表达密度较低，仅为纹状体中的56.58%，结果见Tab 2，Fig 1 ～3。

2.3 外源性吗啡慢性处理对大鼠脑区中D2受体表达的影响 与空白对照组相比，5 mg·kg－1吗啡训练10d后，Mor组大鼠腹侧被盖区、纹状体和伏隔核中D2受体水平降低(均为P＜0.01)，分别减少了37%、20%和27%。结果见Tab 2，Fig 1～3。

Fig 1 Immunohistochemical staining of D2 receptor in ventral tegmental area of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Fig 2 Immunohistochemical staining of D2 receptor in striatum of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Fig 3 Immunohistochemical staining of D2 receptor in nucleus accumbens of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Tab 1 Effects of progesterone on time that the rats spent in the drug-paired chamber of the test apparatus(T/s，±s，n=8)

Tab 1 Effects of progesterone on time that the rats spent in the drug-paired chamber of the test apparatus(T/s，±s，n=8)

C:Trained with 15 mg·kg－1cyclodextrin plus 5 mg·kg－1saline;Mor:Trained with 15 mg·kg－1cyclodextrin plus 5 mg·kg－1morphine;PROG:Trained with 15 mg·kg－1progesterone plus 5 mg·kg－1saline;PROG+Mor:Trained with 15 mg·kg－1progesterone plus 5 mg·kg－1 morphine.BT:Before training，AT:After training.＊＊P ＜0.01 vs C;##P＜0.01 vs BT;△△P＜0.01 vs Mor

C Mor PROG PROG+Mor BT 171±36 169.0±45 172±48 175.0±53 AT 173±41 237.0±51＊＊##177 ±60 183.0±56△△

2.4 单独给予外源性神经甾体孕酮对大鼠脑区中D2受体表达的影响 与空白对照组比较，单独给予15 mg·kg－1孕酮训练10 d，D2受体的数量在各个脑区中未有变化(P＞0.05)。

Tab 2 Effect of PROG on the MOD of D2 receptor in hippocampus and striatum of rats brain( ± s，n=8)

Tab 2 Effect of PROG on the MOD of D2 receptor in hippocampus and striatum of rats brain( ± s，n=8)

VTA:Ventral tegmental area;ST:Striatum;NA:Nucleus accumbens;＊＊P＜0.01 vs C;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Mor

VTA ST NA C 51.95 ±5.20 91.82 ±6.19 84.45 ±6.29 Mor 32.33 ±7.61＊＊ 73.41 ±3.26＊＊ 61.98 ±3.54＊＊PROG 54.74 ±6.18 88.38 ±7.19 86.76 ±5.72 P+Mor 30.13 ±6.58 86.62 ±4.52△ 85.37 ±4.46△△

2.5 孕酮对吗啡CPP大鼠相关脑区中D2受体表达的影响 与吗啡组比较，在给予吗啡的前10 min给予15 mg·kg－1孕酮进行条件性训练10 d后，大鼠纹状体和伏隔核中D2受体水平升高(P＜0.05和P＜0.01)，但腹侧被盖区中还是保持较低的水平(P ＞0.05)，结果见 Tab 2，Fig 1～3。

3 讨论

阿片类物质的精神依赖是指用药才能达到心理满足，驱使其觅药和滥用。关于精神依赖的发生机制，以Wise和Bozart为代表的“精神刺激”学说认为，追求阿片类药物带来的欣快感和奖赏效应(正性强化作用)是引起依赖形成的始动因素。药物的正性强化效应主要涉及3个大脑系统，即:中脑边缘多巴胺系统、内源性阿片肽系统和β-氨基丁酸/谷氨酸能神经系统。本实验采用免疫组化技术，根据本实验室前期的工作基础，有选择性的测定了与阿片类奖赏回路相关的部分脑区中D2受体的表达。在实验进行过程中，我们根据Chemicon公司所提供的资料，在抗体效价的1∶200～1∶500区间中，采用了1∶200、1∶300、1∶400和1 ∶500分别进行预实验，结果均不是十分理想，最后抗体的效价到1∶100时，发现免疫反应性最强。从Tab 2中可以发现，在空白对照组动物的不同脑区中，D2受体在纹状体、伏隔核、腹侧被盖区等处都有分布，但存在着很大的差别，其中以纹状体和伏隔核中的密度较高，这与以往的研究报道结果相一致［12］。

研究表明，吗啡产生精神依赖的神经解剖基础是伏隔核、腹侧被盖区、额叶皮质、海马和杏仁核等，即所谓的奖赏回路。神经生化研究表明［13］，吗啡觅药行为的形成涉及氨基酸、单胺、类阿片肽等多种神经递质。其中腹侧被盖区－伏隔核是一条DA能通路，阿片类药物通过与腹侧被盖区神经元上的阿片μ受体结合，降低GABA能神经元活性，减少GABA的释放，从而取消了对DA能神经元的紧张性抑制，导致伏隔核内DA释放增加，被公认为是吗啡产生奖赏效应的主要神经生物学基础［13］。但也有研究认为［14－15］，促进纹状体内 DA 释放增加，亦是大多数成瘾类药物的一个共同特征，阻断腹侧纹状体的DA释放可以降低成瘾药物的大部分作用，比如条件性位置偏好。本研究发现，吗啡CPP形成时，腹侧被盖区、伏隔核和纹状体内D2的表达均明显减少，分别减少37%、20%和27%，均有统计学意义，这提示在吗啡所致的CPP发生的病理过程中，中枢神经系统内D2受体发生了适应性变化，此变化可能参与了吗啡CPP的形成，腹侧被盖区、伏隔核及纹状体内D2受体水平的变化对吗啡觅药行为具有重要的意义。

以往的许多研究证据表明，D1和D2受体在药物依赖中有相似的作用，两种受体都参与药物的运动效应和行为敏感化，D1和D2受体的拮抗剂都能阻断吗啡导致的活动增强，所以D1和D2受体可能在药物的强化、奖赏、活动增强、行为敏感化等方面都有重要的作用。但是，它们可能通过各自不同分受体后传导途径，参与到强化等的调节过程，D1受体可能参加与感觉成分有关的强化反应，而D2受体可能更多的与成瘾过程中的觅药行为有关［16－17］。伏隔核的壳部属于边缘系统，是参与多种成瘾性药物奖赏效应的部分，该部位尽管接受杏仁核、额叶皮质、海马、颞叶皮层及大部分丘脑核团的传入投入，但主要接受来自于中脑腹侧被盖区的DA能投射［18］，大量的研究发现中脑被盖区－伏隔核－额叶皮质是成瘾性药物奖赏效应的最后公共通路［19］，在我们的实验中，在给予吗啡的前10 min给予15 mg·kg－1孕酮进行条件性训练10 d后，在行为学上表现为大鼠吗啡精神依赖得到了有效控制［9－11］，神经生化上表现为伏隔核和中脑腹侧被盖区内DA水平明显降低［14］，分子生物学水平上表现为大鼠纹状体和伏隔核中D2受体水平明显升高18%和39%，该结果提示，外源性神经甾体孕酮可以通过改变吗啡精神依赖时明显降低的D2受体水平，进而影响中枢单胺类神经递质的合成和释放，这一过程是孕酮对大鼠吗啡CPP实现逆转的有效途径之一。所以，根据我们的实验结果可以推测，孕酮与吗啡合用时可能直接解除了吗啡对伏隔核区DA转运子的抑制效应，D2受体水平升高使细胞外DA浓度降低，从而产生逆转大鼠CPP的效应。与吗啡组相比，孕酮+吗啡组大鼠尽管在中脑腹侧被盖区中D2受体水平未见明显升高，但受体的活性是否发生了改变，是值得进一步深入研究的问题。

综上所述，本实验表明大鼠吗啡条件性位置偏爱形成时，腹侧被盖区、纹状体和伏隔核中D2受体表达水平下降;孕酮伴随给药时可以逆转大鼠条件性位置偏爱的形成，纹状体和伏隔核中D2受体表达水平的改变可能参与了上述逆转过程。

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