PPARδ激动剂GW501516调节小鼠骨骼肌线粒体生物合成和纤维类型转换的作用

方海琴，张 勇，许佑君，吴英良

(1.天津体育学院天津市运动生理与运动医学重点实验室，天津 300381;2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳 110016)

骨骼肌既是执行运动及调节机体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官，也是一可塑性器官。人类许多代谢疾病如糖尿病等可出现肌萎缩、肌纤维类型改变［1］。近来的报道指出［2］，在长时间静坐、少动人群中，由于线粒体不能完全氧化体内脂肪酸导致不完全代谢产物蓄积，代谢疾病发生。苯氧乙酸化合物GW501516已经进入三期临床试验，是目前受到人们关注最多的选择性PPARδ受体激动剂［3］。PPARδ受体分布在骨骼肌和棕色脂肪等多种组织中，在控制脂肪酸氧化方面起着重要作用，运动训练能导致此受体含量的增加。Wang等［4］2004年报道在PPARδ转基因鼠中，骨骼肌由Ⅱ型向Ⅰ型发生了转变，COXⅡ、COXⅣ等线粒体标志性蛋白含量明显升高，且耐力运动到力竭的时间和运动距离都远远高于野生型。这些研究提示，PPARδ可能在促进骨髂肌线粒体的生物合成和骨骼肌肌纤维发生代谢性质的转变中具有重要调节作用。因此，本研究以C57BL/6小鼠为对象，观察和比较GW501516补充和(或)耐力训练对线粒体生物合成和骨骼肌肌纤维类型的影响，并探讨其分子机制，以期为其用于肌萎缩/病理性肥大相关疾病、残疾康复、糖尿病等代谢疾病的治疗提供初步的实验依据。

1 材料

1.1 动物 ♂ C57BL/6小鼠，体质量(20±2)g，由军事医学科学院实验动物中心提供。小鼠购入后适应性喂养1周，苦味酸编号，单只分笼饲养，自由进食，每日记录饮水量及激动剂干预量。实验总时程16周。

1.2 主要试剂与药品 GW501516由沈阳药科大学许佑君教授馈赠。PGC-1α一抗(Santa Cruz CA)，PPARδ、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa和 β tubline单抗(均购自ABcam公司)，HRP标记的二抗(中杉金桥生物技术公司)，甲苯胺蓝(Amoroso)。

1.3 仪器设备 动物电动跑台(天津运动医学研究所)，台式高速低温离心机AvantiTM30(Beckman Co，USA)，DU800型可见-紫外分光光度计(Beckman Co，USA)，垂直电泳槽(Bio-Rad Co，USA)，蛋白转印槽(Bio-Rad Co，USA)，稳压电泳仪(Lab net Co，USA)，BLATER 冰冻切片机(Attenpon Co，Ger-many)，显微镜 AVNOX(Olympus Co，Japan)，透射电子显微镜(Philips EM208S)。

2 方法

2.1 动物分组 80只C57BL/6小鼠随机分为5个组，分别为:对照组(C)、耐力运动训练组(T)、低剂量GW501516组(LG)、低剂量GW501516并耐力运动训练组(TG)，高剂量GW501516组(HG)，每组16只(剂量因素本论文不做讨论)。

2.2 实验动物激动剂干预及耐力训练模型 小鼠适应性喂养1 wk后，LG、HG和TG小鼠开始随饮水补给GW501516，逐渐增量。补充剂量从1 mg·kg-1逐渐升高至3 mg·kg-1及10 mg·kg-1时，分别固定在3 mg·kg-1和10 mg·kg-1的低、高两个剂量。

［5］方法，T和TG组小鼠进行无坡度跑台训练，14 m·min-1，每次50 min，每周5次，全程监控小鼠耐力训练，共15周。

2.3 动物取材及标本制备 各组小鼠均以10%水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉后，迅速取出腓肠肌。按纤维走行方向取部分腓肠肌，即刻按所需截面修正为约1 mm3的立方小块，迅速以电镜固定液固定，定时1 h，取出用磷酸缓冲液冲洗干净，重复3次。将固定标本制备超薄切片，透射电镜观察，拍照，分析。另取部分腓肠肌，剔除肌膜，迅速放入液氮预冷的异戊烷中，保存于-70℃;按照编号取出相应的组织，待温度回升到-25℃时OTC包埋，冰冻切片，厚度为5 μm，每例样本按照“一对一”连续切片，分别用于肌纤维类型(异染性染料ATP酶法)检测［6］。剩余腓肠肌，液氮速冻，-80℃冻存备用。

2.4 小鼠腓肠肌ATP酶染色及肌纤维类型分析参照文献［6］(Ogilvie RW)以异染性染料法测定腓肠肌ATP酶活性，并在Olympus显微照像系统下观察并拍照记录。染色片中呈阳性的I型肌纤维显深蓝色，Ⅱa型纤维显浅蓝色，Ⅱb型骨骼肌纤维为阴性未被着色，呈白色，IPP图像系统处理，电脑格度扫描，计算出各类肌纤维的构成比例。

2.5 骨骼肌 PPARδ、PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量测定［7］取适量液氮冻存骨骼肌组织匀浆，用 RIPA法提取骨骼肌中PPARδ蛋白，NP-40法提取骨骼肌全细胞蛋白(PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa)，以考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度，确定合适的上样量。蛋白电泳完毕后，采用湿法将蛋白质电转印至PVDF膜，根据预染蛋白Marker剪取目的蛋白条带。按各蛋白所用一抗的说明书，稀释一抗，4℃孵育过夜后，TBST洗膜，HRP标记的二抗(中杉金桥生物技术公司)室温温育1～2 h;使用LumiGLO®Chemiluminescent Substrate(KPL)进行发光底物孵育，曝光。使用Quantity ONE(Bio-Rad)软件对目的蛋白进行光密度分析，以β-tubulin为内参蛋白。目的蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/β-tubulin蛋白灰度值。

2.6 统计学处理 激动剂补充与耐力训练为本实验涉及的两种干预因素，两个因素既有单独效应也表现出交互作用，故采用SPSS 13.0软件中的2*2析因分析法进行统计分析检验。实验结果以±s表示。

3 结果

3.1 小鼠腓肠肌超微结构观察 如Fig 1所示:透射电镜6 000倍下观察，小鼠骨骼肌超微结构显示出:无激动剂干预的C组和T组，线粒体呈粒状或杆状，体积小、数目相对较少;激动剂干预各组(LG、TG)线粒体呈椭圆形，排列整齐，数目明显增多，提示线粒体的生物合成增加。

Fig 1 Transmission EM photos of mice’s gastrocnemius muscles(×6 000)C:Control;T:Training;LG:Low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-1);TG:Training and low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-1)

3.2 GW501516及耐力训练对小鼠腓肠肌PPARδ、PGC-1α和 COXIV及 MHCs蛋白表达的影响 如Fig 2所示:A图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.01)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌PPARδ蛋白表达量均较C组提高;B图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌PGC-1α蛋白表达量均较C组提高;C图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌COXIV蛋白表达量均较C组提高;激动剂和训练在小鼠骨骼肌以上各蛋白表达量变化中均有交互作用(P＜0.05)。

D图中，LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌MHCⅠ蛋白表达量均较C组提高，T组较C组无增加;E图中LG组(P＜0.01)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌MHCⅡ蛋白表达量均较C组降低;F图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌MHCⅡa蛋白表达量均较C组提高;激动剂和训练在小鼠腓肠肌MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量变化中有交互作用(P＜0.05)。

3.3 小鼠腓肠肌异染性染料ATP酶染色图片分析如Fig 3所示，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.01)Ⅱb型肌纤维(%)均较C组降低;T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.01)Ⅱa型肌纤维(%)均较C组提高;相对于C组，T组的Ⅰ型肌纤维比例无变化;TG组的Ⅰ型肌纤维明显增加。激动剂和训练在小鼠各型肌纤维(%)变化中有交互作用(P＜0.01)。

Fig 3 Metachromatic staining of mice’s gastrocnemius(A)and the analysis of muscle types(%)(B)A:TypeⅠ fibers were stained dark blue，type Ⅱa fibers were stained light blue，and TypeⅡb fibers were white;*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 exhibited additional enhancing effects in TG group by GW501516 and training

4 讨论

Oliver等［3］在 2003 年研发了 GW501516，此化合物对PPARδ的激动作用具有很强的选择性，其选择性高出其它亚型1 000倍，在nmol·L-1的浓度水平就可以激动PPARδ。Wang等［4］实验证明在服用GW501516激动剂10 d后，C57鼠的线粒体生物合成和呼吸氧化和骨骼肌慢肌纤维的基因皆有上调。

线粒体的生物合成(mitochondrial biogenesis)，是指线粒体的种系发生也可以指线粒体的个体发生的过程。细胞内线粒体的生物合成至少包括以下两种改变:①单位体积组织中线粒体含量的改变，②线粒体本身成分的改变，如线粒体蛋白/磷脂的构成比例的改变。线粒体生物合成是一个复杂的过程，包括核基因和线粒体基因的激活、转录、翻译、蛋白质前体的运输以及进入线粒体的蛋白质的正确组装等多个步骤。运动和电刺激引起的肌肉收缩会诱导线 粒 体 生 物 合 成 已 成 共 识［8-9］。PGC-1α 即PPARGC-1α(PPAR γ coactivator-1α)是线粒体合成途径中一个关键因子［10］，其属于 PGC-1家族，是PPAR γ的转录辅激活因子，也是通用的辅激活因子，同时PGC-1α是PPAR s及甲状腺素受体(TR)的强烈转录协同刺激因子，对线粒体的生物合成和细胞能量代谢起着关键的调控作用［11］。另有Lin等［12］研究发现，PGC-1α是I型肌纤维的生理性调节因子，当PGC-1α在富含Ⅱ型纤维(快肌纤维)的肌肉里表达升高时，其可导致肌肉形态、基因及功能发生变化，促进I型肌纤维的形成。Arany等［13］曾报道PGC-1α的辅因子PGC-1β的增多上调了线粒体生物合成，使骨骼肌纤维的Ⅱx型纤维增多。

PGC-1α的表达受很多因素影响，已明确PGC-1α可以与大多数核激素受体包括PPARδ在内的超家族成员，以不同的方式与其发生分子对接，进而调控其生物学功能［14］，这也提示可以考虑从激活PPARδ上调PGC-1α的表达，增加由PGC-1α调控的线粒体生物合成分子机制的为切入点进行研究观察。

我们参考Arany等［13］的实验方法，用电镜观察骨骼肌超微结构，也发现了GW501516补充组小鼠骨骼肌线粒体合成明显增加。从蛋白分析结果可以看出，GW501516补充可明显增加小鼠骨骼肌PGC-1α、COXIV蛋白含量，说明伴随着PPARδ受体的激活，诱导了小鼠骨骼肌的线粒体生物合成。

骨骼肌由慢缩肌纤维和快缩肌纤维组成。根据肌球蛋白ATP酶染色或(和)肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)异构体的表达，成年啮齿动物骨骼肌纤维可单纯地分为Ⅰ型(氧化型慢缩肌，线粒体极为丰富)和Ⅱa型(糖氧化型快缩肌)、Ⅱb型(糖酵解型快缩肌)、Ⅱx型(介于Ⅱa与Ⅱb之间)。骨骼肌既是执行运动及调节机体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官，也是一可塑性器官。不同的代谢功能需求和代谢变化(如运动、饮食的改变)，骨骼肌纤维大小和类型可产生相应的适应性改变。高果糖饮食不仅可以导致胰岛素抵抗(IR)，而且用ATP酶染色可见慢肌纤维比例的下降［15］。IR和糖尿病显示骨骼肌慢肌比例下降［1］。

Luquet等［16］首次使用PPARδ的转基因小鼠，观察到这种小鼠骨骼肌中慢肌纤维比例的明显增加。Wang等［4］在 PPARδ转基因小鼠的研究中，运用慢肌肌钙蛋白以及异染性染料ATP酶染色发现，PPARδ转基因小鼠的肌纤维类型发生了明显改变，即快肌纤维向慢肌纤维的转换。

与转基因动物研究不同，以往的研究对于运动训练能否造成骨骼肌纤维从Ⅱ型肌纤维(快肌类型)向Ⅰ型肌纤维(慢肌纤维)类型转换的结论并不一致。Demirel等［17］注意到SD大鼠75%强度跑台训练10周的实验中，当训练时间为每天30 min和60 min时，没有观察到足底肌MHC蛋白组成的改变，但训练时间延长至90 min时观察到MHCs组成的改变。Perhonen等［18］Wistar大鼠跑台训练，测得的趾长伸肌和比目鱼肌肌纤维组成无明显改变。近年来人们通过MHCs的观察研究，在运动对骨骼肌纤维类型的影响上持有的观点渐趋一致:即耐力运动对骨骼肌的纤维类型影响大多局限于Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx之间的转变。

本研究中以耐力训练为运动模型，对C57鼠进行15周的跑台训练(每天50 min)，未观察到运动小鼠骨骼肌纤维比例以及肌球蛋白重链MHCs有明显肌纤维类型上的转换。但在GW501516激动剂的长期干预下，小鼠骨骼肌纤维表现出从快肌纤维向慢肌纤维的转换，尤其TG组可见明显增加。

我们的研究结果结合文献［4，16］报道说明，不同于单纯运动训练，无论是转PPARδ基因还是PPARδ激动剂干预，都可以促使实验动物骨骼肌纤维类型的转换。

我们还发现GW501516与耐力训练存在交互作用，这可能是运动会使骨骼肌长链不饱和脂肪酸氧化增加，而使PPARδ内源性配体增加。因此，在同剂量激动剂干预的情况下，由于运动因素的加入，加大了受体被激活的程度。此外，运动上调了PGC-1α，PGC-1α与PPARδ相互应答，使二者的活性与表达协调共增，作用叠加。

综上所述，本研究用小鼠外源性补充PPARδ激动剂GW501516并辅以运动的实验模型，证实了单纯耐力训练和GW501516补充都可诱导小鼠骨骼肌线粒体生物发生，同时GW501516补充促进了骨骼肌纤维类型从糖酵解型向有氧氧化型转换，而单纯耐力训练未发生肌纤维类型转变。其机制可能为GW501516激活PPARδ受体后，与受体共激活因子PGC1α协同作用，进而上调线粒体的生物合成，并促使小鼠骨骼肌代谢类型的转化。

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