以siRNA表达载体稳定抑制缝隙连接蛋白43表达的睾丸间质细胞和睾丸支持细胞系的建立

郑素平，洪晓婷，王 琴，陶 亮

睾丸中的非生殖细胞主要包括睾丸支持细胞和睾丸间质细胞，这两种细胞对精子的生成和睾丸正常功能的维持具有重要作用。其中睾丸支持细胞构成血睾丸屏障、维持睾丸内正常微环境，对生殖细胞起着支持和营养作用;睾丸间质细胞则分泌雄激素等活性物质以调节生殖功能。近年来的研究表明［1］，这两种细胞的作用与其细胞间的缝隙连接(gap junction，GJ)功能密切相关。GJ是细胞间的一种特殊通道，它沟通相邻细胞的胞质，介导细胞间直接的信号传递。GJ由特殊的连接蛋白——connexin(Cx)组成，迄今为止发现的Cx有20种，通常以其分子量来命名，如分子量为43 ku的 Cx命名为Cx43［2-3］。睾丸支持细胞表达 Cx43、Cx32等9种连接蛋白，其中Cx43占90%以上;睾丸间质细胞则仅表达Cx43。由Cx43组成的GJ介导了睾丸支持细胞对生精细胞的支持和营养作用，对睾丸间质细胞的内分泌活动也起重要调节作用，但作用机制不明［1］。阻碍该领域研究进展的一大障碍是迄今尚无能特异、直接改变GJ通道功能的药物和方法。本研究采用RNA干扰 (RNA interference，RNAi)这一特异性干扰目标基因表达的方法，通过设计针对Cx43基因的RNA干扰序列，构建能在真核细胞中表达Cx43-siRNA的质粒，并导入睾丸支持细胞和睾丸间质细胞，建立能稳定表达siRNA的睾丸间质细胞和睾丸支持细胞系，并证明了该两种细胞系上的Cx43蛋白表达及GJ功能能够被长期稳定抑制。本研究为进一步研究Cx43及其组成的GJ在睾丸非生殖细胞中的作用提供了有用工具。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂 小鼠睾丸支持细胞株(TM4细胞)及睾丸间质细胞株(TM3细胞)均购自美国ATCC公司;siRNA表达质粒pSilencerTM2.1-U6 neo购自美国Ambion公司;DH5α大肠杆菌和DNA片段购自上海生工公司;T4 DNA连接酶购自NEB公司;质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司;G418购自Merck公司;Cx43单克隆抗体购自Sigma公司;HRP标记的山羊抗小鼠二抗、ECL-plus化学发光剂和DC蛋白定量试剂盒购自Bio-Rad公司;阳离子脂质体转染试剂(LipofectamineTM2 000)购自Invitrogen公司。

1.2 siRNA序列的设计与合成 在GenBank检索出小鼠Cx43的mRNA全长序列，遵循siRNA设计原则，利用Invitrogen公司siRNA在线设计软件，设计了针对小鼠Cx43蛋白的3个干扰RNA序列，分别为“CAGTCTGCCTTTCGCTGTA”，“GAACCTACATCATCAGCAT”和“GCTCACGTGTTCTATGTGA”。经BLAST检索确认与其它已知小鼠基因序列无同源性。以“BamH I酶切位点+siRNA正义序列+发夹环(TTCAAGAGA)+siRNA反义序列+终止信号+HindⅢ酶切位点”为原则合成寡核苷酸单链及互补链。

1.3 Cx43-siRNA质粒的构建 将合成的互补的寡核苷酸单链加入到退火缓冲液中反应，退火产物与线性化载体pSilencer 2.1-U6 neo在T4 DNA连接酶作用下连接，构建出3种能表达Cx43-siRNA的质粒:Cx43-siRNA1、Cx43-siRNA2及 Cx43-siRNA3质粒。以Ambion公司提供的pSilencer 2.1-U6 Negative Control作为阴性对照质粒，其上带有阴性对照的干扰 RNA序列:“ACTACCGTTGTTATAGGTG”，该序列与已知小鼠基因序列无同源性。将重组质粒转化DH5α感受态菌，收集转化后的菌液，涂布在含氨苄青霉素的LB培养皿上，37℃倒置培养12～16 h，挑取阳性菌落，扩增并送上海生工公司进行测序鉴定。

1.4 质粒转染及稳定阳性细胞克隆的建立 扩增培养含目标质粒的DH5α大肠杆菌，以质粒提取试剂盒提取质粒。将对数生长期的细胞以8×104密度接种于12孔板，用含5%马血清、2.5%小牛血清的DMEM/F12培养液培养，至80% ～90%融合时以脂质体转染试剂LipofectamineTM2 000将质粒转染细胞。转染后48 h，收获细胞备用。稳定转染则在转染后24 h消化传代，以10个/cm2接种至10 cm培养皿，继续培养24 h后，更换为含100 mg·L-1G418的培养液进行筛选。10～20 d后，干扰质粒组和阴性对照质粒组均可见抗性克隆形成，未转染组细胞全部死亡。以无菌克隆环挑取单细胞阳性克隆消化传代并扩大培养。

1.5 Western blot检测蛋白表达 冰上裂解细胞，超声破碎，4℃，12 000 ×g，离心 30 min，取上清液以DC蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将含20 μg蛋白的样品90℃水浴5 min变性，经SDS-PAGE电泳(8%分离胶)分离后电转印至硝酸纤维素膜上。脱脂奶粉封闭，加入Cx43一抗(1∶4 000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入 HRP标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育30 min，洗膜后用增强型化学发光底物(ECL)显影曝光。用Bio Imaging system(Gene Genius)对胶片进行灰度扫描分析。以β-actin为内参对照，蛋白表达强度以Cx43蛋白表达灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

1.6 “Parachute”荧光示踪法检测GJ功能 “Parachute”荧光示踪法是检测GJ功能的一种常用方法［4］。将细胞接种于12孔板，培养至融合后，取其中一孔作为“供体细胞”，加入荧光指示剂Calcein-AM(0.5 μmol·L-1)和 DiI-CM(1 μmol·L-1)孵育30 min。Calcein-AM进入细胞后，其上所带的乙酰甲酯(acetoxymethyl ester，AM)被胞内脂酶水解而形成发绿色荧光的calcein，不能透过细胞膜，但能经GJ传递至邻近细胞。Dil-CM是一种亲脂性细胞膜染料，不能通过GJ传递到毗邻细胞，用于识别供体细胞。胰酶消化收获荧光标记好的供体细胞，以1∶200接种到已生长融合的细胞(接受细胞)上。培养4 h，待“供体细胞”与“接受细胞”间形成稳定的GJ后，倒置荧光显微镜下观察拍照，计数一个“供体细胞”周围含有绿色荧光的“接受细胞”的数目，作为评价GJ功能的指标。

2 结果

2.1 Cx43-siRNA表达载体的鉴定 测序结果证实，所获得的Cx43-siRNA表达质粒目的片段与预期完全相符(Fig 1)。表明siRNA真核表达载体构建成功。

2.2 瞬时转染Cx43-siRNA质粒后，TM4细胞中Cx43的表达水平 Cx43是一种磷酸化蛋白，在聚丙烯电泳中能分离出3条带，分子质量在43～45 ku之间，分别为非磷酸化 形式(P0)和两种磷酸化形式(P1 和 P2)［5］。Western blot结果显示，瞬时转染3种Cx43-siRNA质粒后，TM4细胞上Cx43蛋白的3种形式(P0、P1和P2)均受到不同程度的抑制，以Cx43-siRNA3的抑制效果最佳。转染阴性对照质粒的细胞，其Cx43表达水平无改变(Fig 2)。

Fig 1 Results of DNA sequencing

Fig 2 Expression of Cx43 in TM4 cells after being transiently transfected with siRNA expression vectorsP0，unphosphorylated Cx43;P1 and P2，phosphorylated Cx43.*P＜0.05 vs control

2.3 稳定表达Cx43-siRNA细胞株Cx43蛋白表达的变化 以干扰效果最佳的Cx43-siRNA3质粒转染TM3细胞和TM4细胞，经G418筛选获得4株阳性细胞克隆，在20～22次传代后，所获得的4株细胞克隆全部稳定存活，随机挑选1株细胞检测其Cx43蛋白表达及其形成的GJ功能。Western blot结果显示，这两种细胞株与对照组相比，Cx43表达水平均明显下降(Fig 3)。

Fig 3 Expression of Cx43 in stably transfected TM3 cells and TM4 cells*P＜0.05 vs control

Fig 4 Dye couping through GJ composed of Cx43 in stably transfected TM3 cells(A)and TM4 cells(B)(200×)*P＜0.05 vs control

2.4 稳定表达Cx43-siRNA细胞株GJ功能的变化“Parachute”荧光示踪法检测结果显示，与对照组相比，稳定表达Cx43-siRNA的TM3细胞和TM4细胞calcine传递细胞数明显减少，表明这两种细胞的GJ功能均明显降低(Fig 4)。

3 讨论

GJ是细胞之间信号传递的一种重要方式，广泛存在于几乎所有的实质脏器中。它在同步细胞的活动、维持细胞内环境稳定、控制细胞的生长和发育中发挥重要的作用［2］。相反，Cx的异常表达及GJ功能的减弱或消失将一定程度上阻碍了细胞间信号传递，进而导致心律失常、肿瘤等多种疾病的发生［6-7］。Cx在不同的器官、组织中分布不同，Cx43是睾丸组织中表达最丰富的连接蛋白，也是组成睾丸组织中GJ的主要连接蛋白［1］。睾丸间质细胞之间、睾丸支持细胞之间以及睾丸支持细胞和生殖细胞间均存在大量由Cx43组成的GJ。这些GJ通道在精子发生过程中发挥重要作用［8］。Cx43本身及其形成的GJ对睾丸支持细胞的增殖和分化起调节作用［9］。睾丸支持细胞中Cx43对维持血-睾丸屏障的完整性也起着重要作用［10］，Cx43的敲除可能导致血-睾丸屏障及睾丸支持细胞GJ复合物的分解［9］。此外，Cx43形成的GJ还介导睾丸间质细胞的内分泌活动［11］。Cx43也是二硝基苯、棉酚及顺铂等生殖毒物的作用靶点［12］。研究GJ在睾丸生理、病理中的作用，将为男性生殖系统疾病研究开拓新的方向。但是，由于缺乏能选择性作用于GJ而改变GJ功能的药物和方法，使人们难以深入研究GJ在睾丸组织中的生理功能和它在疾病发生、发展中的作用。

GJ是一种结构特殊的蛋白质通道，与其它膜通道不同，GJ两端开口都在细胞内，因此，难以找到直接作用于GJ的工具药，这为研究其功能带来了困难。而RNAi技术作为一种调控特定基因表达的手段，能够高效、特异地抑制目的基因表达，被广泛用于基因功能鉴定和基因治疗，从而为研究GJ功能开辟了新的方法。传统的RNAi技术是以化学方法合成长度为21～23个核苷酸序列siRNA，瞬时转染进入细胞后发挥其高效阻抑靶基因表达的作用，但合成费用昂贵，受转染效率的影响，抑制效率也不高，而且只能达到短期抑制(2～7 d)。siRNA特异性表达载体的发明为细胞内合成siRNA创造了条件。以“siRNA正义序列+发夹环+siRNA反义序列”为原则设计DNA模板克隆入siRNA特异性表达载体并转染细胞后，其在细胞内转录产生发夹样的siRNA，在Dicer酶的作用下，发夹环被切除，生成siRNA从而引起基因沉默。载体上所带的抗性基因能用于筛选出稳定转染细胞，从而实现更长时间及更高效的基因沉默效应。本研究成功构建了Cx43-siRNA真核表达载体，并将其稳定转染至两种睾丸非生殖细胞系，从而建立了Cx43被长期抑制的两株细胞系。以Western blot及“Parachute”荧光示踪法检测证实，此两株细胞系的Cx43蛋白水平均明显降低，GJ功能均被明显抑制。以siRNA表达载体稳定抑制Cx43表达的睾丸间质细胞和睾丸支持细胞系的建立，为研究Cx43及其组成的GJ在睾丸中的作用以及与睾丸疾病发生的关系提供了有效的工具。

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