糖尿病大鼠肾脏水通道蛋白-2 mRNA的表达及黄芪的调节作用

穆 鑫，袁 霞，康 白，何国荣，杜冠华

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的内分泌疾病，常伴有内分泌调节紊乱及水钠代谢障碍，肾脏病变尤为突出。以往认为糖尿病患者多尿的症状是由于高血糖引起的渗透性利尿，而最近研究发现［1］水通道蛋白也在其尿液浓缩及水代谢失调过程中发挥重要作用。在1、2型糖尿病人和糖尿病动物模型中均发现血管加压素(AVP)浓度增加数倍，AVP的增加很可能是机体的一种代偿反应，而水通道蛋白-2(aquaporin-2，AQP-2)是唯一受AVP调节的水通道蛋白。更令人感兴趣的是糖尿病机体排泌增加的部位和AQP-2存在的部位都是肾脏的集合管，故AQP-2在糖尿病尿液的浓缩过程中的表达引起人们的关注［2］。

近年来实验研究发现［3］黄芪对糖尿病大鼠精氨酸血管加压素系统的异常有明显的改善作用，并可纠正其下丘脑血管加压素的过度表达，而AQP-2是目前比较明确的唯一的AVP调节集合管水通透性的靶分子，黄芪治疗糖尿病利水消肿改善糖尿病水平衡代谢紊乱的作用是否与影响AQP-2的分布与表达有关，国内外尚未见报道。因此，本实验旨在研究糖尿病大鼠肾脏集合管中AQP-2 mRNA的表达水平及黄芪对其的影响，揭示黄芪治疗糖尿病的分子生物学机制，为该药的临床应用提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Spragne-Dawley(SD)大鼠，♂，180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号:SCXK(京)2007-0001。

1.1.2 试剂和仪器 链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司;UNIQ-10柱式总 RNA抽提试剂盒与MMLV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司;SYPR Green PCR Master Mix购于美国ABI公司;AQP-2 RT-PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;胰岛素放射免疫药盒购于北京原子高科核技术应用股份有限公司;C肽放射免疫分析试剂盒购于天津协和医药科技有限公司;黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产;其他试剂为国产分析纯。主要仪器:5700型定量基因分析仪购于美国PE公司;One TouchⅡ血糖测定仪及试纸购于美国Janson and Janson公司;BH6020型组合式γ计数器购自北京核仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的制备 SD大鼠禁食12 h后，左下腹腹腔注射链脲佐菌素55 mg·kg-1，72 h后用One TouchⅡ血糖测定仪测尾静脉血糖，血糖在 16.7 mmol·L-1以上者为造模成功［4］。

1.2.2 分组与给药 健康♂ SD大鼠40只，按体质量随机分为4组，每组10只。① 糖尿病模型组(DM组);②小剂量黄芪治疗组(LD组):糖尿病模型确立后d 2，予以黄芪注射液5 g·kg-1·d-1腹腔注射;③大剂量黄芪治疗组(HD组):糖尿病模型确立后d 2，予以黄芪注射液10 g·kg-1·d-1腹腔注射;④正常对照组(NC组)。各组动物均自由饮水、进食，连续用药6周，糖尿病模型组大鼠每日腹腔注射等量生理盐水。

1.2.3 糖尿病大鼠血糖测定 实验结束前用One TouchⅡ血糖测定仪测各组大鼠尾静脉血糖。

1.2.4 糖尿病大鼠尿量测定 予大鼠50 ml·kg-1生理盐水水负荷，30 min后，逐一挤压大鼠下腹部排尽余尿，各组给药后，立即放入代谢笼，收集给药后24 h尿液。

1.2.5 取材 末次给药6 h后用3%戊巴比妥钠麻醉动物，经颈动脉取血约5 ml，室温静置约20 min，用离心机以1 500 r·min-1离心15 min，分离血清后于-20℃冷冻保存;在大鼠处死前迅速取出肾脏髓质组织标本，放入冻存管，立即置于液氮中固定，后转入低温冰箱-70℃保存。

1.2.6 血清胰岛素、C肽含量测定 按照胰岛素放射免疫药盒、C肽放射免疫分析试剂盒说明书用组合式γ计数器测定血清样品中胰岛素、C肽的含量。

1.2.7 RT-PCR检测AQP-2 mRNA的表达 按照UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明提取总的RNA，按MMLV第1链cDNA合成试剂盒说明逆转录合成第1条链cDNA，从每个样品中取10 μl用于PCR。实时 PCR反应:10 μl DNA模板、2×SYPR Green PCR Master Mix 25 μl、forward primer 1μl、reverse primer 1 μl、灭菌去离子水补足 50 μl，95℃ 预变性 3 min，95℃，17 s，61℃，30 s，72℃，0 s，共40 次循环。AQP-2 forward primer为 5′-GACTGTGCTTAGTGCATCTCATTTTAT-3′，reverse primer 为 5′-AGGATCATGCAAACTCTGTTCGT-3′，扩增长度为 91 bp。β-actin forward primer:5′-CCTGTGGCATCCATGAAACTAC-3′，reverse primer:5′-CTTCTGCATCCTGTCAGCGAT-3′，扩增片段长度为134 bp。

2 结果

2.1 黄芪对糖尿病大鼠血糖的影响 糖尿病模型组、小剂量与大剂量黄芪治疗组大鼠血糖均明显高于正常对照组(P＜0.05)，小剂量与大剂量黄芪治疗组大鼠血糖虽较模型组有所降低，但差别无统计学意义(P＞0.05)，见Tab 1。

Tab 1 Effect of astragalus membranaceus on blood glucose in rats with diabetes mellitus(±s，n=10)

Tab 1 Effect of astragalus membranaceus on blood glucose in rats with diabetes mellitus(±s，n=10)

*P＜0.05 vs NC group

Group Blood glucose/mmol·L -1 NC 6.88±0.94 DM 21.99±3.13*LD 20.40±2.44*HD 19.27±1.44*

2.2 黄芪对糖尿病大鼠血清胰岛素、C肽的影响

糖尿病模型组、小剂量黄芪治疗组与大剂量黄芪治疗组大鼠血清胰岛素、C肽水平均明显低于正常对照组(P＜0.05)，小剂量与大剂量黄芪治疗组大鼠血清胰岛素、C肽水平虽较模型组有所增高，但差别无统计学意义(P＞0.05)，见Tab 2。

Tab 2 Effects of astragalus membranaceus on the levels of serum insulin and C-Peptide in rats with diabetes mellitus±s，n=10)

Tab 2 Effects of astragalus membranaceus on the levels of serum insulin and C-Peptide in rats with diabetes mellitus±s，n=10)

*P＜0.05 vs NC group

Group Insulin/mIU·L-1 C-Peptide/μg·L -1 NC 51.60±7.89 0.25±0.07 DM 29.25±5.05* 0.13±0.04*LD 30.48±2.77* 0.14±0.03*HD 33.94±4.25* 0.16±0.04*

2.3 黄芪对糖尿病大鼠尿量的影响 糖尿病模型组、小剂量黄芪治疗组与大剂量黄芪治疗组大鼠尿量均明显高于正常对照组(P＜0.05)，实验结束时，小剂量与大剂量黄芪治疗组大鼠尿量高于糖尿病模型组，差别有统计学意义(P＜0.05)，见Tab 3。

Tab 3 Effect of astragalus membranaceus on urinary volume in rats with diabetes mellitus(±s，n=10)

Tab 3 Effect of astragalus membranaceus on urinary volume in rats with diabetes mellitus(±s，n=10)

*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs DM group

Group Urinary volume/ml NC 4.10±1.29 DM 27.10±2.08*LD 31.00±2.79*#HD 35.30±1.89*#

2.4 黄芪对糖尿病大鼠肾脏AQP-2 mRNA表达的影响 实验结果表明，糖尿病模型组大鼠肾髓质AQP-2mRNA的表达明显高于正常对照组(P＜0.05)，小剂量与大剂量的黄芪治疗均可使其表达下调(P ＜0.05)，见 Tab 4。

Tab 4 Effect of astragalus membranaceus on mRNA expression of AQP-2 in rats with diabetes mellitus(±s，n=10)

Tab 4 Effect of astragalus membranaceus on mRNA expression of AQP-2 in rats with diabetes mellitus(±s，n=10)

*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs DM group

Group AQP-2/Ct β-actin/Ct AQP-2/β-actin NC 16.79±1.03 15.97±0.73 1.05±0.05 DM 13.98±0.45 14.75±0.39 0.94±0.02*LD 14.65±0.59 15.30±0.57 0.97±0.01*#HD 15.56±1.20 15.61±0.69 1.00±0.04*#

3 讨论

STZ能选择性地损伤动物胰岛β细胞，引起细胞坏死，从而诱发形成胰岛素依赖型糖尿病。胰岛素和C肽都是由胰岛β细胞分泌，测定血清胰岛素和C肽的浓度，可以反映胰岛β细胞的功能。本实验研究显示，糖尿病组大鼠血糖明显升高，血清胰岛素和C肽水平明显降低，说明大鼠胰岛β细胞功能受损，符合糖尿病大鼠的特点。黄芪注射液为传统中药黄芪的提取物的灭菌水溶液，其主要成分为黄芪皂苷类、黄芪多糖、氨基酸及微量元素等，具有益气固表，利水消肿，补中益气等功效［5］。黄芪可以缓解多种疾病的水钠潴留，临床上常用于糖尿病的辅助治疗。本实验研究发现，糖尿病大鼠经黄芪治疗后，血糖水平有所降低，血清胰岛素和C肽水平都有所升高，但差异均无统计学意义，推测与用药剂量、用药时间有关，单用黄芪降糖效果并不明显，故临床上应常与胰岛素或其他药物联合应用，效果更佳。

肾脏集合管是尿液分泌的最后决定性部位，AQP-2在集合管主细胞上表达丰富，对肾脏浓缩功能起重要的作用［6］。AQP-2的表达主要受AVP调节，当AVP释放入循环后，AVP与主细胞管周膜上受体结合，使主细胞内cAMP增高，后者激活cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)，将AQP-2蛋白磷酸化，触发AQP-2由胞质囊泡向管腔膜转移，致使集合管对水通透性增加，即短期调节机制。如AVP水平持续升高数小时或更长时间，可激活cAMP反应元件结合蛋白(CREB)，促使AQP-2基因活化，表现为AQP-2 mRNA和蛋白表达增强，即长期调节机制。在糖尿病大鼠体内AVP的浓度是增高的，这是机体的一种代偿反应，可以通过对AQP-2的调节，增加集合管对水的重吸收，在糖尿病早期可减少尿量。在糖尿病晚期，机体处于失代偿状态，回吸收水分虽然增多，但尿量依然增加。与以往的研究一致［7-10］，本实验研究发现糖尿病大鼠尿量增多，肾脏AQP-2 mRNA表达增加，AQP-2 mRNA表达的增加应属于AVP对AQP-2的长期调节。

糖尿病早期即出现肾脏高血压、高灌注、高滤过等血流动力学异常，对肾脏的损害尤为严重，常因大量蛋白尿漏出、低蛋白血症出现高度浮肿，利尿药长期服用易引起电解质紊乱，低蛋白血症对利尿药不敏感，输注白蛋白制剂价格昂贵，利尿作用短暂，疗效均不满意。本实验在注射STZ诱导糖尿病大鼠模型中发现肾髓质AQP-2 mRNA的表达明显上调，黄芪治疗可有效降低肾髓质AQP-2 mRNA的表达，缓解糖尿病的水钠潴留，其机制可能为:在糖尿病中，肾组织中的肾素-血管紧张素系统(RAS)兴奋性增高［11］，而黄芪则能抑制RAS系统。RAS兴奋是引起血AVP浓度升高的途径之一，因此推测黄芪是通过抑制RAS来降低血AVP浓度从而降低肾脏AQP-2的表达。目前普遍认为黄芪治疗糖尿病利水消肿的功效与其减少尿蛋白的排出、提高血浆白蛋白及恢复肾组织对心钠素的敏感性有关，但本研究发现黄芪可下调肾髓质AQP-2 mRNA的表达，增加水的排出，提示黄芪利水消肿并不完全靠这一机制，也可能部分与AQP-2的下调有关。因此，黄芪可能通过对AQP-2表达的影响直接调控集合管水通透性，避免了利尿药等药物引起的电解质代谢紊乱，其应用价值主要是与某些抗糖尿病药物合用(如胰岛素、磺脲类、罗格列酮等)，对抗其钠水潴留的副作用，为临床用药提供多种选择。

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