家兔离体心脏灌流试验的改进及其效果

袁 亮，高慧丽，高莲莲，刘耀武，陈 楠，肖云云，丁建中，贺尚荣 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

家兔离体心脏灌流试验的改进及其效果

袁 亮，高慧丽，高莲莲，刘耀武，陈 楠，肖云云，丁建中，贺尚荣
(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

目的：通过改进离体心脏灌流试验，延长家兔离体心脏存活时间。方法:健康大耳长白家兔10只随机分为对照组与实验组, 每组5只；通过改良Krebs-Henseleit液(K-H)配方与部分术式操作，比较两组的体外存活时间。 结果：与对照组比较, 改进组家兔离体心脏在体外稳定有节律跳动时间明显延长(P<0.01)。结论：改良部分手术操作以充分暴露离体心脏, 加之去掉K-H配方之Na2EDTA而减少与Ca2+络合以相对提高有效Ca2+浓度,伴同时增加镁离子浓度, 以共同改善心肌收缩功能和延长离体兔心脏存活时间。此简捷模型宜用于专业实验教学与筛选心脏药物等研究。

离体心脏灌流试验；改良配方/术式；离体

1895年Langendorff首创哺乳动物离体心脏进行心脏泵功能研究, 常用Krebs-Henseleit(K-H液)液为离体心脏提供必须的营养物质。使用大型哺乳动物离体心脏的主要困难是动物费用高，参数变异较大，需大容量的灌流液等仪器设备[1]，而蛙心与鼠心体积较小而不易操作, 兔心脏多因离体复苏较难与存活时间较短而应用受限。我们多次发现采用常规K-H液进行离体兔心脏灌注液时，其心脏快速复苏与存活时间均难控制[2]。为此课题组改良Krebs-Henseleit配方和部分剖取兔心脏术式操作，结果显示可适当延长家兔离体心脏的体外存活时间。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 健康大耳长白家兔10只，体质量(2500±100)g， 雌雄不限，由长江大学实验动物中心提供。

1.1.2仪器 LGF-1B型Langendorff灌流仪， HS-4CB型恒温水浴槽，RM6240生物信号采集系统，均为成都仪器厂产品。

1.1.3试剂 肝素钠注射、乌拉坦、KCl(20090828)、MgSO4·7H2O(20090613)、CaCl2(20090728)均购于天津市博迪化工有限公司；KH2PO4(20080327)、NaHCO3(20080525均为成都市科龙化工试剂厂生产；C6H12O6·H2O(20090616为天津市红岩化学试剂厂产品。以上试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1 改良K-H液配方 采用双蒸水、按表1新鲜配制常规K-H与改良K-H，并置4℃普通冰箱内备用(pH7.4)，临用时加入葡萄糖。同时制备冰块备用。

表1 两种K-H液配方 g/L

1.2.2 家兔离体心脏模型的制备 10只实验家兔随机分为对照组与改进组，每组5只。常规经兔耳缘静脉注射0.3ml肝素钠注射液抗凝后，行20%乌拉坦静脉注射麻醉(5ml/kg)。

1)对照组。常规经正中线开胸摘取兔心脏，快速经主动脉注射4℃充氧的K-H液以冲洗兔心脏血管内残血后，将兔心脏置Langendorff灌流仪[Langendorff灌流仪每10cm液柱内持续出现2～3个气泡为宜，调节并使从Langendorff灌流仪下端流出的灌流液温度维持为(37±0.5)℃，下同]。用常规K-H液从30℃缓升至37℃恒温进行心脏灌流。

2)改进组。经胸骨下角切口、沿右锁骨中线开胸，向左翻起胸壁以充分暴露心脏；钝性分离心包并在近心尖处之壁层心包膜上做一小切口；游离心脏，剪断心底与心脏相连的血管并保留主动脉2～3cm后立即置于用适量冰块维持的4℃充氧的K-H液中，手揉法挤出心腔内残血，快速经主动脉注射4℃充氧的改良K-H液以冲洗心脏血管内残血；同时快速修剪心脏表面附着的其它组织，暴露和结扎主动脉根部并将其固定于Langendorff灌流仪。灌注液温度从30℃缓升至37℃，记录从取出心脏至成功复跳所需时间。

1.2.3 数据信号采集 待心脏成功复跳后，将导水管从肺静脉逆行插入左心室检测左心室内压，将黑、绿、红三个电极探针分别接心尖、右心房、右心室，RM6240生物信号采集系统监测心脏功能状态，自动持续记录离体心脏最长存活时间。

2 结 果

表2 两种处理方法的离体兔心脏存活状态

注：与对照组比较，**P<0.01。

两组离体心脏在4℃ K-H液中短暂停搏，经主动脉根部灌流后1min内即可观测到心脏复跳，一般是两心房首先复跳，而后两心室开始复跳，约10min可稳定跳动，心电图显示部分有心律不齐的表现，但心跳稳定后能维持窦性心律，用RM6240生物信号采集系统可测到规则的左心室内压曲线和心电图。改进组离体兔心脏复苏快且可稳定跳动≥8h，优于对照组(P<0.01)。见表2。

3 讨 论

文献报道制备离体兔心脏多用正中线开胸术式，但课题组多次操作时发现此种方式因视野暴露有限而易伤及心脏，故而改用从兔胸骨下角开始并沿右锁骨中线开胸术式，因为避开了心包区而可免损及心脏；同时将左侧胸壁提起翻向左侧，可以完全暴露心脏的相关解剖结构，尤其是主动脉、肺动脉、上腔静脉、下腔静脉等大血管，便于选择合适的部位剪断血管和取出心脏且操作简便。

我们将离体兔心脏置于周围放置适量冰块的4℃ K-H液的容器中，此种简便条件可使心脏短暂停跳而呈低能耗状态，一方面有利于快速修剪心脏表面附着的多余其它组织以充分暴露并结扎主动脉根部；另一方面低温状态下的心肌细胞内的酶活性受抑，细胞能耗、氧耗下降而减少心脏在无能量供应条件下心肌细胞的代谢损伤。我们注意到，进行离体兔心脏灌流时，灌流液的温度应从30℃缓慢升至37℃约需2～3min，此适应过程可避免从4℃环境直升为37℃的初期供氧与灌流液温度条件变化而带来的心肌内环境紊乱，尤其是心肌酶活性迅速增加和心肌代谢及能耗增加造成的继发性损伤[3]。

与对照组比较，改进组之离体心脏在心跳稳定后能维持窦性心律，可稳定跳动7～8h且重复性良好。Ca2+是维持心肌收缩所必需的物质，心肌兴奋时Ca2+穿过细胞膜进入心肌细胞，激发细胞内收缩蛋白的收缩过程，血钙浓度升高时心肌收缩加强[4]。Na2EDTA是常用的金属离子螯合剂，而改进组的改良K-H液配方中去掉了Na2EDTA，因而减少了Na2EDTA与溶液中Ca2+络合后形成CaNa2EDTA的机会，相对提高灌注液的有效Ca2+浓度而有利于维持心肌细胞的收缩机能。

镁离子在正常细胞代谢的许多酶系统的激活过程中影响细胞对Ca2+摄取及分布，而使Ca2+向细胞内的流动减慢而使细胞内Ca2+减少；通过无钙灌流10～15min后复钙灌流5min造成大鼠离体心肌钙反常损伤，结果显示镁等阳离子保护组之冠流液的乳酸脱氢酶含量均有下降，电镜观察心肌细胞损伤有一定程度减轻。临床应用门冬氨酸钾镁能改善心肌收缩力、传导功能和自律性[5]。本实验中我们将改良K-H液中的镁离子浓度增加近3倍，结合去掉K-H液中Na2EDTA以增加Ca2+浓度与改良部分剖取兔心脏术式操作，达到延长离体兔心脏存活时间的效果。该简易模型可为专业实验教学与心脏药物机制研究提供简便平台，其详细机制有待进一步研究。

[1]李海涛，王俊亚，张东梅，等.离体心脏灌流实验方法的类比研究[J].卫生职业教育，2007，25(15)：116-117.

[2]钟富有，肖海，李洪亮，等.3’-大豆苷元磺酸钠对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].时珍国医国药，2008，19(11)：2590-2591.

[3]刘春，马瑞，余志斌，等.变温过程中大鼠心肌等长收缩发展张力呈双相变化[J].中国应用生理学杂志，1998，14(1)：59-62.

[4]朱大年.生理学[M]. 7版.北京：人民卫生出版社，2008：83.

[5]邱超学，张琴琴.门冬氨酸钾镁防治阿霉素急性心脏毒性30例[J].实用医学杂志，2006，22(22)：2671-2672.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.03.006

R331.31

A

1673-1409(2010)03-R012-03