靶向STAT3基因的RNAi慢病毒载体的构建及在胰腺癌细胞中的表达

杨光 裘正军 刘君 毕维民 明晗昕 黄陈

靶向STAT3基因的RNAi慢病毒载体的构建及在胰腺癌细胞中的表达

杨光 裘正军 刘君 毕维民 明晗昕 黄陈

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指生物体内由双链RNA介导同源序列mRNA的特异性降解，从而导致基因沉默的现象[1]。通过合适的载体将RNA干扰片段转入目的细胞，可以有效地抑制功能基因的表达。信号转导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription3, STAT3)是一个重要的信号转导和转录激活因子，目前已将其定义为癌基因[2]。本实验构建针对STAT3序列的慢病毒载体，转染胰腺癌细胞株SW1990，建立STAT3基因稳定沉默的SW1990细胞系。

一、材料与方法

1．小干扰RNA(siRNA)的设计及合成：根据网站(https://rnaidesigner·invitrogen·com/sirna/)提供的软件设计合成3个靶向STAT3基因(NM_139276)的特异性siRNA，起始位置分别为466位点、 1638位点和1061位点。siRNA-1序列：5′-TAATGTTCTCTATCAGCACAATTTCAAGAGAATTGT-GCTGATAGAGAACATTTTTTTTC-3′，5′-TCGAGAAAAAAAATGTTCTCTATCAGCACAATTCTCTTGAAATTGTGCTGATAGAG-AACATTA-3′；siRNA-2序列：5′-TAACATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAGAGATAGCCGATCTAGGCAGATGTTTTTTTTC-3′；5′-TCGAGAAAAAAaaCATCTGCCTAGATCGGCTATCTCTTGA-ATAGCCGATCTAGGCAGATGTTA-3′；siRNA-3序列：5′-TAA-CTTCAGACCCGTCAACAAATTCAAGAGATTTGTTGACGGGTC-TGAAGTTTTTTTTC-3′，5′-TCGAGAAAAAAAACTTCAGAC-CCGTCAACAAATCTCTTGAATTTGTTGACGGGTCTGAAGTTA-3′。引物由吉凯基因技术有限公司合成。

2．慢病毒包装及病毒滴度测定：应用Hpa I和Xho I酶切法将STAT3寡核苷酸片段插入pGCL-GFP质粒构建过表达STAT3的质粒，转化感受态大肠杆菌，挑选氨苄青霉素抗性菌落并扩增培养。提取质粒DNA，PCR扩增法鉴定阳性克隆并测序。将siRNA连接到病毒载体(吉凯公司)，使用lipofectamine 2000(invitrogen公司)将腺病毒和过表达STAT3的质粒共转染293T细胞，分别收集感染后48 h的293T细胞和培养上清液。裂解细胞沉淀，Western blotting检查STAT3蛋白表达；培养上清离心、0.45 μm滤器过滤。将该病毒粗提液收集到滤杯中并加盖，插入含滤过液的收集管，离心获得病毒浓缩液，置-70℃保存。采用逐孔稀释法测定病毒滴度。

3．慢病毒感染SW1990细胞及细胞STAT3mRNA、蛋白检测：收集对数生长期SW1990细胞，接种于12孔板培养，待细胞融合达30%～40%时，加入适量的STAT3-siRNA病毒感染3 d，观察慢病毒的报告基因GFP，感染效率>50%者继续培养。同时设为感染组及阴性对照表达(STAT3-Con)组收集感染的SW1990细胞。提取细胞总RNA，采用实时 PCR方法检测STAT3 mRNA表达。STAT3上、下游引物序列为5′-CCAAGGAGGAGGCATTCG-3′，5′-ACATCGGCAGGTCAATGG-3′，产物147 bp；内参β-actin上、下游引物序列为5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAGSTAT-3′， 5′-AAGGTAGTTTCGTGGATGCC-3′，产物214 bp。以空病毒载体感染的SW1990为对照细胞。mRNA病毒量以2-ΔΔCt表示。ΔCt= Ct值目的基因-Ct值β-actin，-ΔΔCt= ΔCt对照组- ΔCt实验组。实验重复3次。同时收集细胞，制备匀浆，常规Western blotting检测STAT3蛋白表达。以GADPH蛋白作为内参照，用图像分析软件进行光密度积分值分析。

4．感染细胞增殖检测：无血清培养细胞18～20 h使细胞同步化。继续培养24、48、72、96 h，分别用ATT法检测细胞增殖。用A570值绘制生长曲线。

5．感染细胞周期测定：上流式细胞仪检测。计算细胞增殖指数(proliferation index,PI)，PI=(S+G2)/(G1+S+G2)。

二、结果

1．负载siRNA的慢病毒载体的鉴定：靶向 STAT3的慢病毒载体转染293T细胞的效率约60%～70%，3个siRNA均有显著敲减STAT3表达作用，以siRNA-2效果最为明显(图1)。病毒的滴度为1×109TU/ml。

2．慢病毒感染SW1990细胞后STAT3mRNA和蛋白表达的变化：慢病毒感染SW1990细胞24 h后，发现有荧光蛋白表达，且表达量随时间递增，到72 h达到最大，感染效率大于90%，此后保持在高表达状态，没有明显下降。 感染含siRNA-2慢病毒的SW1990细胞STAT3 mRNA表达明显被抑制，抑制率达80.6%(t=5.085,P=0.007);STAT3蛋白的表达亦明显被抑制，抑制率达78.2%(t=14.278，P=0.000，图2)。

1： 293T细胞组，2：STAT3过表达质粒+病毒载体组，3：STAT3过表达质粒+阴性对照病毒载体组，4：STAT3过表达质粒+含siRNA-1病毒载体组，5：STAT3过表达质粒+含siRNA-2病毒载体组，6：STAT3过表达质粒+含siRNA-3病毒载体组

图1感染负载不同siRNA慢病毒载体的293细胞的STAT3蛋白表达

图2亲本SW1990 和感染阴性对照慢病毒及含siRNA慢病毒的SW1990细胞的STAT3蛋白表达

3．细胞增殖的变化：培养48、72、96 h后，STAT3-siRNA组细胞增殖能力较STAT3-Con组或SW1990组明显下降(P<0.05，图3)。

图3 各组SW1990细胞的增殖

4．细胞周期的变化：SSTAT3-siRNA组PI值明显低于SW1990组或STAT3-Con组(t=4.894，P=0.008；t=6.592，P=0.003，表1，图4)。

图4 各组SW1990细胞周期

组别G1期G2期S期G2+S期(PI)SW199035.8±5.949.3±2.814.5±3.263.7±5.7STAT3-Con43.3±2.151.9±3.44.8±1.356.7±2.1STAT3-siRNA52.4±1.043.3±1.14.3±2.147.6±1.2ab

注：与SW1990组比较，aP<0.05；与STAT3-Con组比较，bP<0.05

讨论JAKs/STATs途径将细胞因子的信号从细胞表面传到细胞核的目的基因，调控相关基因的表达。STAT3在多种肿瘤组织中异常表达和激活，并与肿瘤的增殖、分化、细胞凋亡、血管生成、浸润转移和免疫逃避密切相关[3]。因此，有效抑制STAT3表达可能是治疗高表达STAT3肿瘤的关键所在。

目前，RNAi作为一种研究手段被用于特异性抑制相关基因的表达，可成为肿瘤基因治疗的新途径[4-5]。RNAi常用的病毒载体有腺病毒和逆转录病毒载体。慢病毒是逆转录病毒的一种，目前已经广泛应用于基因表达调控、基因治疗等领域。利用慢病毒载体构建的siRNA表达载体，与化学合成的siRNA和瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以代替瞬时表达载体使用，另一方面，慢病毒载体经过包装系统包装后，可用于感染传统转染试剂难以转染的细胞如原代细胞、悬浮细胞等，并且在感染后整合到宿主细胞的基因组，而达到长时间的稳定表达[6]。慢病毒载体转移基因片段具有容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，因此成为携带siRNA的理想载体[7-8]。

Gao等[9]将STAT3特异性siRNA转染到人喉癌Hep2细胞，能下调细胞中STAT3蛋白的表达，抑制细胞的生长，促进

细胞凋亡的现象。Xiong等[10]通过STAT3特异性siRNA体外转染结肠癌细胞，能抑制细胞的生长，诱导细胞的凋亡。本研究构建了靶向STAT3的特异性siRNA序列，通过慢病毒载体感染SW1990细胞，能显著抑制细胞STAT3 mRNA及蛋白表达，阻止细胞进入S期，明显减慢细胞增殖，提示本实验成功构建了STAT3siRNA重组慢病毒质粒，为进一步了解STAT3基因的生物学特性并从分子水平探讨胰腺癌的发生发展机制，提供了有效的工具，具有重要的实验价值。

[1] Hannon GJ.RNA interference.Nature,2002,418:244-251.

[2] Inghirami G,Chiarle R,Simmons WJ,et al.New and old functions of STAT3:a pivotal target for individualized treatment of cancer.Cell Cycle,2005,4:1131-1133.

[3] Haura EB,Turkson J,Jove R.Mechanisms of disease: Insights into the emerging role of signal transducers and activators of transcription in cancer.Nat Clin Pract Oncol,2005,2:315-324.

[4] Kamath RS,Fraser AG,Dong Y,et al.Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.Nature,2003,421:231-237.

[5] Takei Y,Kadomatsu K,Yuzawa Y,et al.A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics.Cancer Res,2004,64:3365-3370.

[6] Liau SS,Ashley SW,Whang EE.Lentivirus-mediated RNA interference of HMGA1 promotes chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic adenocarcinoma.J Gastrointest Surg,2006,10:1254-1262.

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[9] Gao LF,Xu DQ,Wen LJ,et al.Inhibition of STAT3 expression by siRNA suppresses growth and induces apoptosis in laryngeal cancer cells.Acta Pharmacol Sin,2005,26:377-383.

[10] Xiong H,Zhang ZG,Tian XQ,et al.Inhibition of JAK1, 2/STAT3 signaling induces apoptosis,cell cycle arrest,and reduces tumor cell invasion in colorectal cancer cells.Neoplasia,2008,10:287-297.

2009-08-04)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.022

上海市教育委员会科研资助项目(06BE067)

271000 山东，泰安市中心医院普外科(杨光、刘君、毕维民、明晗昕)；上海交通大学附属第一人民医院普外科(裘正军、黄陈)

裘正军，Email：qiuwryb@online.sh.cn