柴胡皂苷d对人胰腺癌细胞IkB激酶β表达的影响

吴葆莹 吴崇旭 张志翔 刘彤

柴胡皂苷d对人胰腺癌细胞IkB激酶β表达的影响

吴葆莹 吴崇旭 张志翔 刘彤

越来越多的研究表明，IκB激酶(inhibit kappa B kinase, IKK)的表达异常在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用[1-3]。中药柴胡具有明显的抗肿瘤作用，但是其具体作用机制不清。因此，本研究观察柴胡主要药理成分——柴胡皂苷d(Saikosaponin d, SSd)对人胰腺癌细胞IKK-β表达和凋亡的影响，为胰腺癌的治疗提供新思路。

一、材料和方法

1．材料：人胰腺癌细胞株PANC1购自意大利IST-Banca公司，DMEM培养基和胎牛血清均为美国Gibco公司产品；Trizol购自美国invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒和PCR试剂盒均购自天根生物技术有限公司；IKK-β兔抗大鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG均为美国Santa Cruz公司产品。

2．细胞培养与分组：PANC1细胞置无血清DMEM培养液培养，800 r/min离心5 min，弃上清；加入含150 ml/L胎牛血清、35.76 g/L HEPES和青、链霉素各100 U/ml的DMEM完全培养液，置5% CO2、37℃孵箱里贴壁生长至融合，隔日换液。待细胞生长至80%～90%融合时，用1.25 g/L胰蛋白酶消化传代。以1×104/孔接种于6孔细胞培养板。将细胞随机分为低、中、高剂量SSd组和对照组，分别加入终浓度为0.625 mg/L、1.25 mg/L、2.50 mg/L的SSd和PBS继续培养24 h后收集细胞。

3．细胞IKK-β mRNA水平检测：Trizol提取各组细胞总RNA，取2 μg总RNA反转录cDNA。IKK-β上游引物5′-AGATCGCCTGTAGCAAA-3′，下游引物5′-CTCCAGTCT-AGGGTCGTG-3′，扩增片断244 bp；内参β-actin上游引物5′-GTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游引物5′-TCATCGTACTCC-TGCTTG-3′，扩增片断233 bp。引物由金思特科技有限公司合成。PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、54℃ 40 s、72℃ 1 min，30个循环，最后72℃ 5 min。产物行琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统扫描，以目的条带与内参条带的灰度值比作为mRNA相对表达量。

4．细胞IKK-β蛋白表达检测：提取各组细胞总蛋白，常规行Western blotting检测。以目的蛋白与内参蛋白条带的灰度值比作为IKK-β蛋白表达量。

5．细胞凋亡检测：采用TUNEL法检测。计数7个阳性细胞数最多的高倍视野的细胞，计算凋亡指数(apoptotic index, AI)。AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。

二、结果

1．IKK-β mRNA和蛋白表达的变化：中、高剂量组细胞IKK-β mRNA水平、蛋白表达显著低于低剂量组与对照组(P值均<0.05，图1、表1)，中、高剂量组之间以及低剂量组与对照组之间无统计学差异。

图1 IKK-β PCR产物电泳图(a: IKK-β;b:β-actin)

组别IKK-βmRNAIKK-β蛋白AI对照组7.860±1.5630.411±0.1920.58±0.16低剂量组6.345±1.9900.364±0.0753.80±0.91a中剂量组3.566±1.217ab0.236±0.068ab7.15±0.86ab高剂量组2.776±0.925ab0.172±0.064ab8.82±1.35ab

注：与对照组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，bP<0.05

2．各组细胞凋亡：不同剂量SSd组的AI均显著增加，且中、高剂量组AI较低剂量组也显著增加(P值均<0.05，表1)。

讨论IKK激酶家族属于Ser/Thr蛋白激酶超家族成员，主要由IKK-α、IKK-β和IKK-γ 3个亚单位组成，其中IKK-α和IKK-β为功能单位，IKK-γ为调节单位，对IKK-α和IKK-β的活性进行调节。在静息状态下IKK处于无活性状态，当细胞受到病原微生物、应激、细胞因子、氧自由基等刺激时，引起细胞内一些上游激酶的活化，从而导致细胞内IKK的丝氨酸残基磷酸化而活化。活化的IKK能使IκB发生降解，导致NF-κB活化，细胞抗凋亡能力增加，促进恶性肿瘤的发生。Li等[4]通过研究发现，人胰腺癌细胞系的IKK-β和NF-κB处于持续激活状态。而Ochiai等[5]利用RNA干扰技术删除胰腺癌细胞IKK-β，此外还应用特异性IKK-β抑制剂IMD-0354抑制其活性，结果发现无论是基因删除还是抑制其活性，均能明显抑制癌细胞NF-κB活性和增殖，同时促进其凋亡反应，表明IKK-β可能是治疗胰腺癌的一个重要分子靶点。

SSd是从传统中药柴胡中分离、提取出来的药理活性最强的成分之一，具有解热、镇痛和抗炎等药理作用。近年研究表明，SSd通过直接细胞毒作用或影响肿瘤细胞黏附及诱导细胞凋亡等，抑制或杀死人肺癌、胃癌、肝癌、白血病细胞和小鼠移植性S-180实体瘤等肿瘤细胞[6-7]，其抗肿瘤的作用引起学者高度关注。本研究以IKK-β为靶点，探讨了SSd对其在胰腺癌PANC1细胞表达的影响。结果显示，中、高剂量组的IKK-β mRNA水平及蛋白表达均显著降低，同时三个干预组的AI值均显著增高，表明SSd能够在基因转录水平和蛋白表达水平抑制PANC1细胞IKK-β表达，促进细胞凋亡，而且这种作用呈一定剂量依赖性，可能是SSd治疗胰腺癌的分子机制。

[1] Li J,Gong LY,Song LB,et al.Oncoprotein Bmi-1 renders apoptotic resistance to glioma cells through activation of the IKK-nuclear factor-kappaB pathway.Am J Pathol,2010,176:699-709.

[2] Bollrath J,Greten FR.IKK/NF-kappaB and STAT3 pathways:central signalling hubs in inflammation-mediated tumour promotion and metastasis.EMBO Rep,2009,10:1314-1319.

[3] Jiang R,Xia Y,Li J,et al.High expression levels of IKKalpha and IKKbeta are necessary for the malignant properties of liver cancer.Int J Cancer,2010,126:1263-1274.

[4] Li L,Aggarwal BB,Shishodia S,et al.Nuclear factor-kappaB and IkappaB kinase are constitutively active in human pancreatic cells, and their down-regulation by curcumin (diferuloylmethane) is associated with the suppression of proliferation and the induction of apoptosis.Cancer,2004,101:2351-2362.

[5] Ochiai T,Saito Y,Saitoh T,et al.Inhibition of IkappaB kinase beta restrains oncogenic proliferation of pancreatic cancer cells.J Med Dent Sci,2008,55:49-59.

[6] 刘振国,陈红,程延安,等.柴胡皂苷d对大鼠实验性肝癌形成的预防作用.西安交通大学学报(医学版),2007,28:643-647.

[7] 王宝峰,程延安,王西京,等.柴胡皂甙D对实验性大鼠肝癌血管形成的抑制作用.世界华人消化杂志,2008,16:1273-1280.

2010-02-04)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.024

300052 天津，天津医科大学总医院中西医结合外科(吴葆莹)，急诊科(吴崇旭)，普外科(张志翔、刘彤)

吴葆莹，Email：0e25@sina.com