人胰腺癌组织中Smad4、VEGF的表达及微血管密度检测

夏青 于观贞 张其胜 王慧

·短篇论著·

人胰腺癌组织中Smad4、VEGF的表达及微血管密度检测

夏青 于观贞 张其胜 王慧

胰腺癌的发生、发展伴随着包括抑癌基因DPC4基因(编码的蛋白为Smad4)在内的许多基因改变，也伴随着肿瘤血管的不断生长。本实验应用免疫组化方法分别检测胰腺癌组织中的Smad4、VEGF的表达，并计数微血管密度(MVD)，以了解三者的关系。

一、材料与方法

1．组织标本：收集长征医院2006年9月至2008年8月手术切除的胰腺癌组织标本82例，男61例，女21例；年龄27～80岁，平均59岁；患者术前均未行放、化疗。病理证实腺癌78例，腺鳞癌4例；癌肿位于胰头58例，体尾部24例；按Edmondson组织学分级，高分化4例，中分化61例，低分化17例。另取经手术以及病理证实的慢性胰腺炎(CP)组织标本8例作为对照。

2．Smad4、VEGF、CD34蛋白检测：采用免疫组化方法，试剂盒购自北京中山公司。石蜡包埋标本连续切片4张，1张行HE染色，另3张行免疫组化染色。兔抗人Smad4多抗购自武汉博士德公司，鼠抗人CD34、VEGF单抗购自Santa Cruz公司。Smad4、CD34、VEGF一抗工作浓度分别为1∶100、1∶200、1∶200。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，已知Smad4、CD34、VEGF阳性的切片作为阳性对照。

Smad4、VEGF染色阳性为胞质呈棕黄色或棕褐色颗粒。每例随机观察5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞占总细胞数的百分率，<5%为阴性，≥5%为阳性[1]。CD34阳性为内皮细胞呈棕黄色或棕褐色，一个内皮细胞或内皮细胞丛为一个微血管,只要结构不相连,其分支结构也作为一个微血管，而厚壁血管或管径>50 μm 的血管则排除在外[2]。在血管密度最高处,高倍镜下计数5个视野的微血管数,其均值表示为MVD。

3．统计学处理：应用SPSS11.5软件，胰腺癌与CP组织的Smad4、VEGF以及MVD比较，采用两样本比较的秩和检验；癌组织的Smad4、VEGF以及MVD相关性采用Sparman等级相关分析法，P<0.05有统计学意义。

二、结果

1．Smad4、VEGF的蛋白表达及MVD：胰腺癌组织Smad4、VEGF的蛋白阳性表达率分别为34.1%、56.1%，MVD为19.00±8.91；CP组织分别为100.0%、12.5%和9.88±4.72。两两比较的差异均有统计学意义(P值均<0.05，图1)。

2．胰腺癌组织Smad4、VEGF表达和MVD与临床参数的关系：胰腺癌Smad4、VEGF表达及MVD与年龄、性别、肿瘤部位、病理类型无关；但高、中分化癌的Smad4阳性表达例数显著高于低分化癌(P值均<0.05)，而高、中分化癌之间无统计学差异， VEGF表达及MVD与肿瘤分化无关(表1)。

图1胰腺癌组织中Smad4(a)、VEGF(b)和CD34(c)的表达(免疫组化 ×200)

表1胰腺癌Smad4、VEGF的表达以及MVD与临床参数的关系

临床指标例数Smad4阳数例数VEGF阳性例数MVD(x±s)性别男61193418.8±8.7女2191219.7±9.6年龄<60岁36132017.8±8.1≥60岁46152619.9±9.5分化高43a114.5±11.2中6124a3619.0±8.9低171919.9±8.6病变部位头部 58223019.1±8.3体尾部2461618.8±10.4病理类型腺癌 78264519.2±9.0腺鳞癌42114.5±6.7

注：与低分化比较，aP<0.05

3．胰腺癌组织Smad4、VEGF表达及MVD间的相关性: Smad4与VEGF间的Spearman系数为-0.244，P=0.027；Smad4与MVD间的Spearman系数为-0.35，P=0.001； VEGF与MVD间的Spearman系数为0.240，P=0.030。Smad4表达阳性者的VEGF表达率为39.3%，MVD为14.71±5.00，均显著低于Smad4表达阴性组的64.8%和21.22±9.69(P=0.028和P=0.002)。

讨论DPC4基因通常在染色体18q区发生改变。在胰腺癌中，DPVC基因的改变率约50%，其中纯合子缺失约30%，突变约20%[3-4]。DPC基因的改变导致DPC蛋白的缺失。本组胰腺癌组织Smad4表达率为34.1%，显著低于CP的100%的表达。

本组结果显示，胰腺癌组织Smad4的表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、病理类型等无关，与郑建明等[5]的报道基本相同；低分化癌的Smad4表达显著低于中、高分化癌的结果与Zhan等[6]的报道相同。在胰腺癌组织中，Smad4与VEGF、MVD呈负相关， VEGF与MVD呈正相关，提示胰腺癌的生长离不开微血管的不断生成以及促血管物质VEGF对血管生成的促进；而Smad4的存在可以抑制胰腺癌微血管生长以及VEGF的表达。与郝强等[7]及Khorana等[8]的结果相符。Khorana等[8]还对部分VEGF阳性以及Smad4阴性患者进行了抗血管生成以及细胞毒作用的辅助治疗，患者的生存期较未进行辅助治疗者明显延长，也间接证实血管干预治疗在延长胰腺癌患者生存期方面起着重要作用。

[1] Korchynskyi O，Landstrom M，Stoika R，et al.Expression of smad protein in human colorectal cancer.Int J Cancer,1999,82:197-202.

[2] Maeda K,Chung YS,Ogawa Y,et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma.Cancer,1996,77:858-863.

[3] 潘小季，孙维佳.胰腺癌组织中DPC4/Smad4的表达及临床意义.湘南学院学报(自然科学版),2005,7:1-3.

[4] 李柯,陆星华.Smad4、Smad6、Smad7在胰腺癌中的改变及其相互关系.临床消化病杂志,2005,4:151-154.

[5] 郑建明，朱明华，倪灿荣,等.TGF-β/Smads信号通路相关蛋白在胰腺上皮内瘤变和胰腺癌组织中的表达.胰腺病学,2004,4:204-209.

[6] Zhan H,Zhang YC,Hu XM, et al.Loss of DPC4 expression and its correlation with clinicopathological parameters in pancreatic carcinoma.World J Gastroen-terol,2003,9:2764-2767.

[7] 郝强,田建明,左长京,等.胰腺癌组织的平均微血管密度和血管内皮细胞生长因子的表达.第二军医大学学报,2005,26:865-868.

[8] Khorana AA,Hu YC,Ryan CK,et al.Vascular endothelial growth factor and DPC4 predict adjuvant therapy outcomes in resected pancreatic cancer.J Gastrointest Surg,2005,9:903-911.

2009-10-27)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.023

200081 上海，上海交通大学附属第一人民医院分院消化内科(夏青、张其胜、王慧)；第二军医大学长征医院肿瘤科(于观贞)

夏青，Email:natureshandong@sina.com