髓样细胞表达的激发受体-1在急性坏死性胰腺炎小鼠中的表达

许爱平 路筝 高军 李淑德 李兆申

·论著·

髓样细胞表达的激发受体-1在急性坏死性胰腺炎小鼠中的表达

许爱平 路筝 高军 李淑德 李兆申

目的检测急性坏死性胰腺炎(ANP)小鼠外周血及胰腺组织中髓样细胞表达的激发受体-1(TREM-1)的表达，探讨其在ANP发生、发展中的作用。方法50只雄性昆明小鼠按随机表法分为对照组，ANP 24、48、72、96 h组。以腹腔注射20%L-精氨酸4 mg/g体重、间隔1 h重复一次的方法制备ANP模型。对照组腹腔注射等容积生理盐水。取血检测淀粉酶、肌酐和谷丙转氨酶含量；取胰腺组织行病理学检查并评分；采用实时定量 PCR法检测外周血白细胞TREM-1 mRNA的表达；免疫组化法检测胰腺组织TREM-1蛋白表达。结果ANP 24 h组小鼠血清淀粉酶、肌酐、谷丙转氨酶水平为(9439±1273)U/L、(84.8±75.9)μmol/L、(158.1±122.1)U/L，均较对照组的(2412±297)U/L、(29.2±19.1)μmol/L、(41.4±7.9)U/L显著升高。ANP组胰腺组织的病理评分随着时间推移而增加。ANP 24、48、72、96 h组的TREM-1 mRNA相对表达量分别为15.55、30.36、15.77、28.32， ANP 48 h组的表达量显著高于其他时间点组(P值均<0.01)，而胰腺组织TREM-1蛋白表达随胰腺炎的病程进展无显著变化。结论TREM-1可能还通过促发其他炎症因子参与ANP的进展过程。

胰腺炎，急性坏死性； 髓样细胞表达的激发受体-1； 炎症趋化因子类

髓样细胞表达的激发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM-1)属于免疫球蛋白超家族，它可能是触发并扩大炎症反应、介导脓毒性休克的关键介质[1]。大量研究结果证实，TREM-1在脓毒症、肺部感染、炎症性肠病、细菌性脑膜炎等炎症性疾病的鉴别、诊断和预后判断中有重要价值。Wang等[2]报道，TREM-1 mRNA在轻、重型急性胰腺炎患者的白细胞中表达增加。本实验观察急性坏死性胰腺炎(ANP)小鼠外周血及胰腺组织中TREM-1 mRNA及蛋白的表达，探讨TREM-1在胰腺炎发生、发展中的作用及可能机制。

材料和方法

一、实验动物及分组

健康雄性昆明小鼠50只，清洁级，体重20～22 g，由第二军医大学动物中心提供。按随机表法分成对照组，ANP 24、48、72、96 h组，每组10只。采用腹腔注射20% L-精氨酸4 mg/g体重、间隔1 h重复注射一次的方法制备ANP模型。对照组腹腔注射等容积生理盐水。术后各时间点分批处死小鼠，心脏取血，留取血清和胰腺组织标本。

二、检测项目及方法

1．血清淀粉酶、肌酐、谷丙转氨酶检测：应用HITACHI-7150型自动生化分析仪测定。

2．胰腺病理学检查：部分胰腺组织常规行病理学检查，并参考Rongione标准进行评分。

3．外周血TREM-1 mRNA检测：外周血分离、弃血清、裂解红细胞后，应用Trizol抽提白细胞总RNA，置-80℃备用。根据Genbank中的基因序列自行设计引物，上游5′-CTGTGCGTGTTCTTTGTC-3′，下游5′-GGTTCCTTCCCGTCTG-3′，产物133 bp；内参GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，产物233 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)逆转录成cDNA。采用SYBR Premix Ex TagTM(Takara公司)行荧光实时定量PCR，反应条件:95℃ 10 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s，40个循环。结果以Ct值显示，△Ct值= Ct值目的基因-Ct值内参基因；△△Ct值=△Ct值目的基因-△Ct值内参基因；以对照组表达量为1，2-△△Ct值即为目的段基因较对照组mRNA表达的倍数。

4．胰腺组织TREM-1蛋白检测：采用Envison两步法检测。大鼠抗小鼠TREM-1 Antibody购自R&D公司，以PBS代替一抗作为阴性对照。TREM-1定位于胞膜、胞质，阳性染色为棕黄色或棕褐色。光镜下随机计数1000个细胞，计算染色细胞所占的百分数，≥20%为阳性，<20%为阴性。染色强度：淡黄色为+，黄色++，棕黄色+++，褐色++++。

三、统计学处理

结 果

一、血清淀粉酶、肌酐、谷丙转氨酶的变化

ANP组小鼠血清淀粉酶、肌酐、谷丙转氨酶水平均较对照组显著升高。淀粉酶、肌酐、谷丙转氨酶在制模后24 h均达峰值，此后逐渐降低(表1)。

表1 各组血清淀粉酶、肌酐、谷丙转氨酶的变化

注：与对照组比较，aP<0.05

二、胰腺病理变化

对照组小鼠胰腺无明显变化。ANP 24 h组小鼠肉眼可见腹腔微量腹水;48 h组腹腔有大量血性积液,并见胰腺水肿、坏死;72 h和96 h组病变更为严重。镜下见24 h组胰腺小叶间隙略增宽、水肿、充血、炎细胞浸润；48 h组胰腺小叶结构紊乱,小叶间水肿、充血、炎细胞浸润加重；72 h组胰腺大片坏死，中性粒细胞浸润明显增加；96 h组炎细胞大量浸润,弥漫性腺泡细胞坏死,坏死区周围炎细胞浸润,部分腺泡呈孤岛状,核固缩、脂肪组织坏死(图1)。

ANP各组病理评分见表2。胰腺组织炎症反应、水肿程度和坏死随着病程进展程度加重(P<0.05)，出血病变在48、72和96 h组间无统计学差异(P=0.773)。

三、外周血TREM-1 mRNA表达的变化

ANP 24、48、72、96 h组的TREM-1 mRNA相对表达量分别为15.55、30.36、15.77、28.32， ANP 48 h组的TREM-1 mRNA表达量显著高于其他时间点组 (P值均< 0.01)。

图1ANP 24 h组(a)、48 h组(b)、72 h组(c)、96 h组(d)胰腺组织病理改变(HE ×100)

表2 ANP各组胰腺组织病理评分

注：与ANP 24 h组比较，aP<0.05,bP<0.01

四、胰腺组织中TREM-1蛋白表达的变化

对照组胰腺无TREM-1蛋白表达。ANP组有TREM-1的表达(图2)，24 h时11例TREM-1表达阳性，其中+++以上5例；48 h时11例阳性，+++以上6例；72 h时11例阳性， +++以上6例。TREM-1蛋白表达随胰腺炎的病程进展无显著变化。

讨 论

Bouchon等[3]应用特异性抗TREM-1单克隆抗体证实了血液中的中性粒细胞和CD14单核/巨噬细胞表达TREM-1。Colonna等[4]报道，正常肺组织的巨噬细胞也表达TREM-1。机体感染时，浸润的中性粒细胞及被感染的皮肤和淋巴结中的上皮细胞均能高表达TREM-1。TREM-1可促进炎性因子分泌，引起炎症反应的增强、放大，导致过度的炎症反应[5]。此外，TREM-1在天然免疫和获得性免疫应答方面都起着重要作用。

图2 ANP组胰腺组织中TREM-1的表达(SP ×400)

Wang等[2]检测轻、重型急性胰腺炎患者及正常人白细胞中TREM-1 mRNA的表达，结果显示，与正常人相比较，急性胰腺炎(AP)患者白细胞中TREM-1的表达量明显上调，且与患者病情严重程度密切相关，推测TREM-1在AP尤其是SAP的发生、发展中可能起着至关重要的作用。

本实验结果显示，ANP小鼠外周血中TREM-1 mRNA 的水平随着病程的进展逐渐升高，48 h达到顶峰，后逐渐下降，表明TREM-1的表达并非随着病程的进展呈线型增高。此外，胰腺组织中TREM-1蛋白表达随ANP的病程进展亦无显著变化。因此，初步推测TREM-1作为炎症介质在炎症反应过程中可能还通过促发其他炎症因子参与整个疾病进程。

[1] Bouchon A,Facchetti F,Weigand MA,et al.TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock. Nature,2001,410:1103-1107.

[2] Wang DY,Qin RY,Liu ZR,et al.Expression of TREM-1 mRNA in acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2004,10:2744-2746.

[3] Bouchon A,Dietrich J,Colonna M.Cutting edge:inflammatory responses can be triggered by TREM-1,a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes.J Immunol,2000,164:4991-4995.

[4] Colonna M,Facchetti F.TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells):a new player in acute inflammatory responses.J Infect Dis,2003,187:S397-S401.

[5] Radsak MP,Salih HR,Rammensee HG,et al.Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in neutrophil inflammatory responses: differential regulation of activation and survival.J Immunol,2004,172:4956-4963.

2009-11-13)

(本文编辑：吕芳萍)

ExpressionofTREM-1inmicewithacutenecrotizingpancreatitis

XUAi-ping,LUZheng,GAOJun,LIShu-de,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-Shen,Email;zhsli@81890.net

ObjectiveTo detect the expression of triggering receptor expressed on myeloid cells-1(TREM-1) in mice with acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsMale kunming mice (n=50) were randomly divided to control group, ANP 24, 48, 72, 96 h group. ANP model was induced by intraperitoneally injection with 20% L-arginine at a dose of 4 mg/g each, 1 h apart. Mice in control group

intraperitoneally injections of same amount of normal saline. Serum amylase, creatinine, and ALT were examined and pathological evaluation of pancreatic tissues was performed. The expression of TREM-1 mRNA in peripheral blood leucocyte was determined by RT-PCR. The expression of TREM-1 protein in pancreatic tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsSerum amylase, creatinine, and ALT in ANP 24 h were (9439±1273)U/L, (84.8±75.9)μmol/L, (158.1±122.1)U/L, which were significantly higher than those in control group [(2412±297)U/L,(29.2±19.1)μmol/L, (41.4±7.9)U/L)]. The pathological scores of the pancreas in ANP group increased corresponding to time. The expressions of TREM-1 mRNA in ANP 24, 48, 72, 96 h group were 15.55, 30.36, 15.77, 28.32, and the expressions of TREM-1 mRNA in ANP 48 h group was significantly higher than that in other groups (P<0.01). The expressions of TREM-1 protein in the pancreas did not significantly change corresponding to time.ConclusionsTREM-1 may be involved in the development of ANP by triggering other inflammatory factors.

Pancreatitis，acute necrotizing； Triggering receptor expressed on myeloid cells-1； Chemokines

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.014

2008年度国家自然科学基金面上项目(30772138)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化科

李兆申，Email：zhsli@81890.net