AMD3100对胰腺癌细胞AsPC-1及其移植瘤血管生成的影响

高振军 孔庆云 吴恺 王兴鹏

·论著·

AMD3100对胰腺癌细胞AsPC-1及其移植瘤血管生成的影响

高振军 孔庆云 吴恺 王兴鹏

目的探讨非肽类特异性CXCR4拮抗剂AMD3100对胰腺癌细胞株AsPC-1细胞增殖及其移植瘤生长的影响。方法AsPC-1细胞分为对照组、基质细胞衍生因子-1(SDF-1α)处理组、AMD3100处理组和SDF-1α+AMD3100处理组，MTT法检测细胞增殖，Western blotting检测血管内皮生长因子(VEGF)表达。建立AsPC-1细胞裸鼠移植瘤模型，应用AMD3100瘤内及瘤周注射，观察移植瘤的生长，免疫组化法检测裸鼠移植瘤的微血管密度(microvessel density, MVD)。结果SDF-1α可明显促进AsPC-1细胞增殖(1.430±0.122对1.002±0.001，P<0.05)，而同时应用AMD3100处理能抑制这种增殖反应(0.983±0.068 对 1.430±0.122，P<0.05)；SDF-1α亦可促进AsPC-1细胞VEGF的表达(0.565±0.047 对 0.439±0.034，P<0.05)，而同时用AMD3100处理可抑制这种效应(0.450±0.071 对 0.565±0.047，P<0.05)。AMD3100可抑制AsPC-1细胞皮下移植瘤的生长，第24天的抑瘤率达59.5%，移植瘤的MVD显著减少(28.56±6.94 对 98.75±20.60，P<0.01)。结论AMD3100在体外和体内均可抑制AsPC-1细胞增殖及其移植瘤的血管生成。

胰腺肿瘤； AMD3100； 细胞增殖； 血管生成

胰腺癌是一种具有高侵袭倾向的恶性肿瘤，80%以上的病例会发生局部蔓延和淋巴结转移[1]。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)是一类在肿瘤侵袭转移中受到越来越多关注的趋化因子，与其受体结合可促进肿瘤的生长、增殖、侵袭、转移及血管生成[2-3]。AMD3100是一种小分子非肽类特异性CXCR4拮抗剂，属于双螯环类(Bicyclam)化合物，可与CXCR4第二胞外环的门冬氨酸残基结合，抑制SDF-1与CXCR4结合，以及由此引发的下游信号转导反应。本研究旨在观察SDF-1α及AMD3100对胰腺癌细胞株AsPC-1细胞增殖及其移植瘤血管生成的影响。

材料与方法

一、细胞培养

人胰腺癌细胞系AsPC-1购自中科院细胞库，常规培养传代。

二、细胞增殖实验

采用MTT法。取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按5×103个/孔接种于96孔板，贴壁生长后换无血清培养基，分成4组，分别加AMD3100(Sigma-Aldrich公司) 100 ng/ml、SDF-1α(Peprotech公司)100 ng/ml及SDF-1α+AMD3100和只加无血清培养基的对照组，每组设5个平行孔。继续培养24 h后，每孔加5 mg/ml的MTT(Sigma-Aldrich公司)20 μl，培养4 h，弃上清液，每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪测定A490值。

三、细胞VEGF蛋白表达检测

采用Western blotting法。提取上述各组培养24 h细胞的总蛋白，常规行Western blotting。抗VEGF一抗1∶500稀释、二抗1∶500稀释，最后ECL发光。以β-actin为内参照。图像扫描仪扫描条带灰度值，以VEGF条带与β-actin条带灰度值比表示VEGF相对表达量。

四、动物及体内成瘤实验

Balb/c裸鼠，雌性，5～6周龄，体重20 g左右，购自中国科学院上海实验动物中心(合格证书No.159)。实验前在SPF级环境适应性饲养1周。无菌条件下给每只裸鼠背部皮下接种AsPC-1细胞2×106个，以皮下结节直径>0.5 mm3为成瘤标准。1周后将10只成瘤裸鼠数字表法随机分为AMD组和对照组。AMD组在瘤体长径达0.5 cm时注射AMD3100 7.5 mg/kg体重，一半剂量注入瘤体中央，另一半注射在瘤周，1次/3 d。对照组注射等容积生理盐水。每3 d测量肿瘤长、短径，并计算肿瘤体积：V=ab2/2(a为肿瘤长径，b为肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线。治疗后24 d处死动物，剥取瘤体称瘤量。抑瘤率(inhibitory rate, IR)=(1 -治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。并将瘤体迅速放入10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片。

五、移植瘤微血管密度(MVD)检测

采用免疫组化SABC染色法，严格按免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司)说明操作。以PBS代替一抗作阴性对照。采用双盲法阅片。结果判断：以胞质出现棕黄色着色为血管内皮细胞阳性，在肿瘤区内单个或成丛的内皮细胞均视为单个血管，只要结构不连接，其分支也作为血管，凡管径>8个红细胞或带有肌层的血管不计数。每张切片随机观察10个高倍镜视野(10×40)，计数MVD。

六、统计学处理

结 果

一、AMD3100对AsPC-1细胞增殖的影响

对照组AsPC-1细胞增殖的A490值为1.002±0.001。AMD3100处理组细胞增殖的A490值为1.005±0.110，与对照组无明显差异(P>0.05)。SDF-1α处理组细胞增殖的A490值为1.430±0.122，显著高于对照组(P<0.05)，而同时用AMD3100处理，则能抑制细胞增殖反应(P<0.05)，A490值为0.983±0.068，与对照组无显著差异(P>0.05)。

二、 AMD3100对AsPC-1细胞VEGF蛋白表达的影响

对照组、SDF-1α组、AMD3100组和SDF-1α+AMD3100组细胞的VEGF表达量分别为0.439±0.034、0.565±0.047、0.426±0.059和0.450±0.071(图1)。SDF-1α可促进AsPC-1细胞VEGF的表达(P<0.05)，而同时应用AMD3100可抑制这种促进效应(P<0.05)。

三、 AMD3100对AsPC-1细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

各组裸鼠生长、饮食、活动情况良好，无死亡。移植瘤外观呈大的球形瘤结节或数个小的瘤结节簇生(图2)。AMD3100组移植瘤生长速度明显小于对照组(P<0.05，图3)，24 d的IR为59.5%。

图1 AMD3100对AsPC-1细胞VEGF蛋白表达的影响

图2 对照组(a)、AMD3100组(b)移植瘤离体图

图3 裸鼠移植瘤生长曲线

四、裸鼠皮下移植瘤MVD变化

AMD3100瘤内注射24 d后，移植瘤的MVD为28.56±6.94，明显低于对照组的 98.75±20.60(P<0.01，图4)。

图4AMD3100组(a)和对照组(b)裸鼠皮下移植瘤MVD(IHC ×200)

讨 论

越来越多的证据表明，在肿瘤微环境中具有复杂的趋化因子/受体网络，与肿瘤的生物学行为有关[4]，CXCR4在许多恶性肿瘤组织中表达水平明显升高，SDF-1和CXCR4结合激活特异性信号转导通路，引起原位和转移瘤的生长。AMD3100可抑制SDF-1与CXCR4的结合，阻断随后的一系列生理过程[5]。

Marchesi等[6]发现，SDF-1α可促进胰腺癌细胞增殖。本实验结果显示，SDF-1α可促进AsPC-1细胞增殖，但这种作用可被AMD3100抑制。体内实验亦显示，在AsPC-1细胞皮下移植瘤体及瘤周注射AMD3100可明显抑制移植瘤的生长，24 d时的抑瘤率接近60%，提示AMD3100在体内外均可显著抑制CXCR4阳性胰腺癌细胞的增长。

癌细胞在体内生长及侵袭转移中需有新生血管的存在，VEGF是一种有效的促血管生成因子，它与MVD增加、肿瘤局部侵袭和转移及术后复发有关[7]。新近的一项研究认为，VEGF是一种CXCR4下游的靶基因[8]。本实验结果显示，SDF-1α可促进AsPC-1细胞VEGF的表达，而AMD3100可抑制这种促进作用，体内实验亦显示AMD3100可抑制移植瘤的血管生成。

[1] Lockhart AC,Rothenberg ML,Berlin JD.Treatment for pancreatic cancer: current therapy and continued progress.Gastroenterology,2005,128:1642-1654.

[2] Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature,2001,410:50-56.

[3] Kollmar O,Rupertus K,Scheuer C,et al.Stromal cell-derived factor-1 promotes cell migration and tumor growth of colorectal metastasis.Neoplasia,2007,9:862-870.

[4] O′Hayre M,Salanga CL,Handel TM,et al.Chemokines and cancer: migration, intracellular signalling and intercellular communication in the microenvironment.Biochem J,2008,409:635-649.

[5] Flomenberg N,DiPersio J,Calandra G.Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells.Acta Haematol,2005,114:198-205.

[6] Marchesi F,Monti P,Leone BE,et al.Increased survival,proliferation,and migration in metastatic human pancreatic tumor cells expressing functional CXCR4.Cancer Res,2004,64:8420-8427.

[7] Niedergethmann M,Hildenbrand R,Wostbrock B,et al.High expression of vascular endothelial growth factor predicts early recurrence and poor prognosis after curative resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas.Pancreas,2002,25:122-129.

[8] Billadeau DD,Chatterjee S,Bramati P,et al.Characterization of the CXCR4 signaling in pancreatic cancer cells.Int J Gastrointest Cancer,2006,37:110-119.

2009-10-12)

(本文编辑：屠振兴)

EffectofAMD3100ontheproliferationandangiogenesisofAsPC-1cells

GAOZhen-jun,KONGQing-yun,WUKai,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,LianyungangFirstHospital,XuzhouMedicalCollege,Lianyungang222002,China

WANGXing-peng,Email:xpwcn@public7.sta.net.cn

ObjectiveTo investigate the effects of blockade on non-peptide specific SDF-1/CXCR4 receptor ligand system with AMD3100 on the proliferation and angiogenesis of human pancreatic cancer cells AsPC-1.MethodsAsPC-1 was divided into control group, SDF-1α group, group, SDF-1α+ AMD3100 group. MTT test was performed to determine the proliferative level of AsPC-1 cells. Vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected with Western blotting assay. Immunohistochemistry was used to detect the microvessel density (MVD) in subcutaneous xenografts of AsPC 1 of nude mice model, which was intratumorally and peritumorally injected with AMD3100.ResultsSDF-1α could induce the proliferation of AsPC-1(1.430±0.122vs1.002± 0.001,P<0.05). While the proliferative effect induced by SDF-1α could be inhibited by AMD3100 (0.983±0.068vs1.430 ± 0.122,P<0.05). SDF-1α could induce the expression of VEGF (0.565 ±0.047vs0.439 ± 0.034,P<0.05). While the protein expression of VEGF induced by SDF-1α on AsPC-1 cells was inhibited by AMD3100 (0.450 ± 0.071vs0.565±0.04,P<0.05). The growth and angiogenesis of subcutaneous xenografts of nude mice model were inhibited by AMD3100; the tumor inhibitory rate was 59.5% at 24th day. The MVD of xenografts was significantly decreased (28.56±6.94vs98.75±20.60,P<0.01).ConclusionsAMD3100 could inhibit the proliferation and angiogenesis of AsPC-1 cells both in vitro and in vivo.

Pancreatic neoplasms; AMD3100; Cell proliferation; Angiogenesis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.010

222002 连云港，徐州医学院附属连云港医院消化科(高振军、孔庆云)；上海交通大学附属第一人民医院消化科(吴恺)；同济大学附属第十人民医院消化科(王兴鹏)

王兴鹏，Email: xpwcn@public7.sta. net. cn