褪黑素对小鼠皮下移植性胰腺癌的作用

方华蓥 许春芳 叶建新

·论著·

褪黑素对小鼠皮下移植性胰腺癌的作用

方华蓥 许春芳 叶建新

目的探讨褪黑素(MT)对Balb/c裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的治疗作用。方法建立Balb/c小鼠皮下胰腺癌移植瘤模型，分别用生理盐水(对照组)、低剂量MT(10 mg·kg-1·d-1)、高剂量MT(20 mg·kg-1·d-1)、吉西他滨(GEM，50 mg·kg-1·d-1)及GEM +高剂量MT(联合)干预，定期测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线，并用MTT法检测小鼠脾脏自然杀伤细胞(NK)活性。结果对照组移植瘤体积为(1.476±0.075)cm3，低剂量MT组、高剂量MT组、GEM组和联合组的移植瘤体积分别为(0.998±0.112)cm3、(0.756±0.128)cm3、(0.746±0.115)cm3和(0.305±0.111)cm3，较对照组显著缩小(P值均<0.01)，并且高剂量MT组移植瘤体积较低剂量MT组小，联合组移植瘤体积最小。对照组NK细胞的杀伤活性为(18.07±1.23)%，低剂量MT组、高剂量MT组和联合组NK细胞的杀伤活性分别为(44.27±3.19)% 、(45.16±3.20)% 和(30.29±2.91)%，较对照组显著增强(P值均<0.01)；GEM组NK细胞的杀伤活性为(14.24±2.70)%，较对照组显著减弱(P<0.05)，而联合组NK细胞的杀伤活性显著高于GEM组(P<0.01)。结论MT能增强荷瘤裸鼠的免疫功能，抑制移植性胰腺癌的生长，与吉西他滨联合应用，则肿瘤抑制作用更强。

胰腺肿瘤； 褪黑激素； 疾病抵抗力； 吉西他滨

褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的吲哚类激素，近期研究显示其对乳腺癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、结肠癌等都有显著的抑瘤作用。我们前期的体外实验研究[1]已证实，MT可以抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖，促进其凋亡。本实验通过建立小鼠移植瘤模型来研究MT对胰腺癌的治疗效果，并探讨褪黑素对荷瘤鼠免疫功能的影响。

材料与方法

一、小鼠胰腺癌模型建立及分组

雌性Balb/c小鼠，4～5周龄，平均体重18 g，由上海斯莱克实验动物学有限责任公司提供；人胰腺癌SW1990细胞株由苏州大学附属一院血液研究所友情馈赠。取对数生长期的SW1990细胞，用无菌冷PBS洗涤后调整浓度至2×107/ml， 取100 μl接种于Balb/c小鼠右侧前肢腋下，接种后第5天皮下肿瘤结节长径约4～5 mm。将荷瘤鼠分成对照组、低剂量MT组、高剂量MT组、吉西他滨(GEM)组和高剂量MT+GEM组(联合组)。对照组于肿瘤周围皮下注射生理盐水；低剂量MT组于肿瘤周围皮下注射MT 10 mg·kg-1·d-1，1周连续注射4 d，连续3周；高剂量MT组于肿瘤周围皮下注射MT 20 mg·kg-1·d-1，注射次数同上； GEM组向腹腔内注射GEM 50 mg·kg-1·d-1，每周第1天和第4天注射，连续3周；联合组于肿瘤周围皮下注射 MT 20 mg·kg-1·d-1和腹腔注射GEM 50 mg·kg-1·d-1，用法同前。治疗开始后定期用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V=a×b2/2。

二、NK细胞杀伤活性测定

1．效应细胞的制备[2]：处死小鼠后迅速无菌摘除脾脏，制备单细胞悬液3 ml，将其轻轻地加到含有小鼠淋巴细胞分离液3 ml的试管中，离心收集白膜层,并用PBS洗涤,再置于细胞培养瓶中室温孵育4 h,去除单核细胞，细胞悬液离心，收集沉淀的细胞，再悬浮，并调整细胞浓度为5×106/ml。

2．靶细胞的制备：K562白血病细胞株由苏州大学附属一院血液研究所友情馈赠。取对数生长期的K562细胞, 调整细胞浓度为5×104/ml。

3．细胞毒实验：将效应细胞、靶细胞各50 μl以100∶1的效靶比加入96孔板中,每样本设三个复孔,同时设单纯效应细胞和单纯靶细胞的对照孔,在37℃ 5%CO2培养箱中共同孵育4 h,加入5 mg/L的噻唑盐(MTT)10 μl后继续孵育4 h,后加入10% SDS-50%二甲基甲酰胺100 μl,待紫色结晶完全溶解后,在酶标仪上测A570值。NK细胞杀伤活性=(A570反应孔-A570自然释放孔)/(A570最大释放孔-A570自然释放孔)×100 %。

三、统计学分析

结 果

一、MT和GEM对胰腺癌皮下移植瘤的影响

接种后第21天，对照组小鼠的肿瘤体积平均为(1.476±0.075)cm3，低、高剂量MT组、GEM组及联合组的皮下移植瘤体积平均为(0.998±0.112)cm3、(0.756±0.128) cm3、(0.746±0.115) cm3和(0.305±0.111)cm3，与对照组相比，差异均具有统计学意义(F=74.641,P<0.01)；低剂量MT组与高剂量MT组、GEM组组间的差异也具有统计学意义(P<0.01)，但GEM组与高剂量MT组间无明显差异(P>0.05)；联合组小鼠肿瘤体积最小，与其他各组间差异均显著(P值均<0.01，图1)。

图1 荷瘤鼠肿瘤生长曲线

二、MT对NK细胞杀伤活性的影响

对照组、低剂量MT组、高剂量MT组、GEM组和联合组的NK细胞活性分别为(18.07±1.23)%、(44.27±3.19)%、(45.16±3.20)%、(14.24±2.70)%和(30.29±2.91)%。高、低剂量MT组及联合组的NK细胞杀伤活性较对照组均显著增强(P值均<0.01),但高、低剂量MT组之间无明显差异(P>0.05)；GEM组NK细胞杀伤活性较对照组显著减弱(P<0.05)；联合组小鼠NK细胞活性显著高于GEM组(P<0.01),与低、高剂量MT组之间无显著差异。

讨 论

为研究MT对胰腺癌的治疗作用,建立胰腺癌的实验动物模型并在体内实验中加以证实是必不可少的。本研究采用的Balb/c裸小鼠是一种免疫缺陷性小鼠,目前被广泛作为人类肿瘤的移植性肿瘤模型[3]。由于裸小鼠T细胞免疫缺陷,所以其NK细胞在抗肿瘤免疫中起着“主力军”的作用,6～8周龄裸鼠的NK细胞在数量和功能上达到高峰，因此本实验取4～5周龄裸鼠做实验对象是一理想的选择。

MT是人和哺乳动物松果体分泌的一种神经内分泌激素，它除了调节昼夜节律的功能外，还具有抗肿瘤、抗氧化的作用[4]。其抗肿瘤机制是多方面的,不仅可以促进肿瘤细胞的凋亡[5]，改变细胞周期[1]，还能增强机体的免疫力。本实验研究结果显示，在移植性胰腺癌的周围皮下注射MT可使肿瘤体积明显缩小，证实MT可抑制胰腺癌的生长。

免疫系统是抑制肿瘤增殖的重要因素。近期研究发现，MT在神经-免疫-肿瘤网络中发挥作用。MT对免疫系统发挥作用的主要靶细胞是NK细胞和吞噬细胞，可以使白血病老鼠的NK细胞数量和活性提高[6]，另外还可以刺激细胞因子的分泌[7]，而这些细胞因子的分泌又可促进NK细胞的活化[8]，为NK细胞的杀伤提供合适的体液环境，使之处于最佳的抗肿瘤状态。本实验结果显示，MT可以显著增强NK细胞的杀伤活性，从而提高机体的免疫力，发挥抗肿瘤作用。本结果还显示，高剂量MT组的NK细胞杀伤活性和低剂量MT组间无明显差异，但两组的移植瘤大小存在明显的差异，提示MT还可能通过其他的机制抑制肿瘤的生长。

在胰腺癌的治疗中，GEM已取代5-FU成为目前胰腺癌一线的临床化疗药。但在实际应用中部分患者对GEM耐药，而且GEM在抑制肿瘤生长的同时,也抑制了正常细胞的生理功能，导致广泛的不良反应,如骨髓抑制引发的免疫功能低下等。众所周知，免疫功能的低下可促进肿瘤的生长，这也是许多化疗药物疗效较差的原因之一。Mills等[9]曾证实，MT无不良反应，并且可降低其他药物的不良反应。本实验也证实了同样的结果，即MT和GEM联合应用对肿瘤的抑制作用强于单独应用GEM，这主要与MT可增强免疫系统的功能、降低GEM的不良反应有一定的关系。

[1] 朱华,许春芳,叶建新.褪黑素对胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响.中华胰腺病杂志,2009,9:115-117.

[2] 王先松，盛秦，关阳.含GPG的寡脱氧核酸与5-氟尿嘧啶联合治疗小鼠肝癌.中华消化杂志，2005,25:212-215.

[3] Yokoi K,Sasaki T,Bucana CD,et al.Simultaneous inhibition of EGFR,VEGFR,and platelet derived growth factor receptor signaling combined with gemcitabine produces therapy of human pancreatic carcinoma and prolongs survival in an orthotopic nude mouse model.Cancer Res,2005,65:10371-10380.

[4] Ruiz-Rabelo JF，Vazquez R，Perea MD，et al.Beneficial properties of melatonin in an experimental model of pancreatic cancer.J Pineal Res,2007,43:270-275.

[5] Weinreb O,Mandel S,Youdim MB．cDNA gene expression profile homology of antioxidants and their antiapoptotic and proapoptotic activities in human neuroblastoma cells.FASEB J,2003,17:935-937.

[6] Miller SC,Pandi-Perumal SR,Esquifino AI,et al.The role of melatonin in immuno-enhancement: potential application in cancer.Int J Exp Pathol,2006,87:81-87.

[7] Srinivasan V,Spence DW,Pandi-Perumal SR,et al.Therapeutic actions of melatonin in cancer: possible mechanisms.Integr Cancer Ther,2008,7:189-203.

[8] Maestroni GJ.Therapeutic potential of melatonin in immunodeficiency states,viral diseases,and cancer.Adv Exp Med Biol,1999,467:217-226.

[9] Mills E,Wu P,Seely D,et al.Melatonin in the treatment of cancer: a systematic review of randomized controlled trials and meta-analysis.J Pineal Res,2005,39:360-366.

2009-09-21)

(本文编辑：屠振兴)

Effectofmelatoninonthepancreaticcancerinmicesubcutaneousxenograft

FANGHua-ying,XUChun-fang,YEJian-xin.

DepartmentofGastroenterology,FirstPeople′sHospitalofSuzhou,SuzhouUniversity,Suzhou215006,China

XUChun-fang,Email：xcf601@163.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of melatonin (MT) on human pancreatic cancer in Balb/c nude mice subcutaneous xenograft model.MethodsPancreatic cancer model was established in Balb/c mice．The mice were treated with normal saline (control group), low dose MT(10 mg·kg-1·d-1), high dose MT(20 mg·kg-1·d-1) , gemcitabine(GEM,50 mg·kg-1·d-1) and high dose MT combination with GEM. Tumor size was measured regularly. The tumor growth curve was drawn.The activity of mice spleen natural killer cell was determined by MTT.ResultsCompared with the controls [(1.476±0.075)cm3], tumor volumes in low dose MT group[(0.998±0.112)cm3], high dose MT group[(0.756±0.128) cm3], GEM group [(0.746±0.115) cm3], combination group [(0.305±0.111) cm3] were significantly decreased (P<0.01), and the tumor size in high dose MT group was smaller than that in low dose MT group, while the tumor size in combination group was the smallest. The activity of mice spleen natural killer cell was (18.07±1.23)% in control group, and they were (44.27±3.19)%,(45.16±3.20)% and (30.29±2.91)% in low dose MT group, high dose MT group, combination group, which were significantly higher than those in the control group; the activity of natural killer cell in GEM group was (14.24±2.70)%, which was significantly lower than that in the control group (P<0.05), but the activity of natural killer cell in combination group was significantly higher than that in the GEM group (P<0.01).ConclusionsMT could improve the immune function of mice, inhibit the growth of tumor, and MT combination with GEM may have more potent antitumor effect.

Pancreatic neoplasms; Melatonin; Disease resistance; Gemcitabine

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.009

苏州市社会发展基金(SSY0619)

215006 苏州，苏州大学附属第一人民医院消化科

许春芳，Email:xcf601@163.com