大鼠两种脑血管痉挛模型的早期脑损伤研究

范议方 韩如泉

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SA H)后脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)是一个灾难性的病理生理状态,是患者病情恶化、致残和致死的重要因素[1]。细胞凋亡在CVS 所致脑损伤中有着重要作用,本研究采用枕大池一次注血及二次注血法复制大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛模型,观察凋亡相关基因Bax 和Bcl-2 在大脑皮层及海马组织中的表达,研究两种模型的早期脑损伤程度。

1 材料与方法

1.1 材料和设备 TUNE L 试剂盒(购自Roche 公司),一抗Bax、Bcl-2(购自Santa C ruz 公司),免疫组化染色试剂盒PV-9002、浓缩型DAB 试剂盒ZLI-9032(购自北京中杉金桥生物技术有限公司);旋转式切片机(Histostat 820,美国), 荧光显微镜(Nikon E600,日本),透射电子显微镜(Hitachi H-7650,日本)。

1.2 实验分组 雄性Wistar 大鼠(8 ～9 周),体重300 g 左右,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,并随机分为假手术组、枕大池一次注血组及二次注血组。

1.3 动物模型制备 10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,备皮(颈枕手术区域及腹股沟区)。在腹股沟区剪开约1 cm 的切口,暴露股动脉并置入24G 套管针,用1 ml 注射器(管壁预先肝素抗凝)抽取0.3 ml 动脉血;大鼠改为俯卧位,于颈枕交界中线切开约1 cm 的切口,在交界区三角形凹陷处穿刺,回抽见脑脊液后缓慢(约2 min)注入动脉血,封闭缝合切口;随即将大鼠置于头低位30°约30 min,以利于血液广泛分布于颅底蛛网膜下腔;一次注血组应用该方法于枕大池注血一次;二次注血组在一次注血后48 h 再次注血。

1.4 标本的留取 大鼠于手术后24 h 过量麻醉下开胸灌注取脑(灌注压力100 cmH2O),首先将穿刺针置入心尖并固定,夹闭腹主动脉,剪开右心耳,灌注0.9%的生理盐水(室温),待流出液体清亮后注入4 ℃4%的多聚甲醛,大鼠上肢剧烈抽动即为灌流成功的标志;待上肢及头颈部僵硬后即断头取脑;取出的脑组织置入4%的多聚甲醛中行后固定;24 h后切取脑片,常规脱水、石蜡包埋、组织切片(厚度为5 μm),行HE 染色观察基底动脉组织结构并计算血管横截面积;用于电镜检查的标本于灌注后取脑置于2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液中固定并制成超薄切片后于透射电镜下观察。

1.5 基底动脉横截面积测量 采用显微镜(Nikon E600)以及计算机图像采集系统对3 组标本基底动脉进行观察并拍片,应用图像处理软件(Image J 1.37)计算横截面积。

1.6 免疫组化染色 按照试剂盒的说明书行免疫组化染色;PBS 代替一抗作为空白对照;分别对3 组标本大脑皮层及海马脑组织Bax 及Bcl-2 的染色情况进行观察并拍片;在每张切片的大脑皮层及海马均分别随机选取5 个视野并进行免疫反应评分(immunoreactivity score, IRS),由阳性细胞的百分数(percent of positive cells, PP)计分与染色强度(staining intensity , SI)计分相乘所得;PP 计分:0分, ＜1%,1 分,1%～25%,2 分,26%～50%,3 分,51%～75%,4 分, ＞75%;SI 计分:1 分,弱染色,2分准[,2中]。等染色,3 分,强染色,SI 计分以多数细胞为

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.5对各组大鼠基底动脉的横截面积、大脑皮层及海马组织中Bax 及Bcl-2 的免疫反应评分行方差分析;结果以±s表示,P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠病死率 假手术组大鼠共20 只, 无死亡;一次注血组大鼠共26 只,死亡3 只,病死率为11.5%;二次注血组大鼠共29 只,死亡10 只,病死率为34.5%。

2.2 光镜下基底动脉的横截面积变化 SAH 后24 h 二次注血组的基底动脉横截面积明显小于假手术组(P＜0.01),略小于一次注血组,但差异无统计学意义(P＞0.05)(图1)。

图1 各组大鼠基底动脉横截面积与假手术组比较, *P ＜0.01

2.3 电镜下海马组织超微形态学观察 假手术组海马神经元正常,细胞核大而圆,染色质呈细颗粒状散在分布于核内;细胞质内可见到椭圆形、哑铃形的线粒体,可见内膜、外膜以及排列整齐的线粒体嵴;一次注血组神经细胞核膜凹陷,核内染色质凝聚,线粒体嵴模糊不清,内质网轻度扩张,神经细胞外周有肿胀的星形细胞触突包绕;少突胶质细胞核内染色质凝聚边集,有些细胞胞膜消失;二次注血组神经细胞核膜凹陷,染色质固缩,线粒体嵴断裂,内质网扩张,溶酶体增多,星形细胞触突水肿,胞体肿胀,脂褐素增多,多聚核糖体部分解聚(图2)。

图2 大鼠海马CA1 区神经元超微结构变化(×10 000倍)A 为假手术组;B 为一次注血组;C 为二次注血组

2.4 TUN EL 检测细胞凋亡 假手术组T UNEL染色后大脑皮层及海马神经细胞着色浅,阳性细胞少见,而注血组阳性细胞较数多,其中一次注血组与二次注血组与假手术组比较均有显著性差异(P＜0.05,表1,图3)。

表1 各组大鼠大脑皮层及海马TUNEL 的IRS(±s, n=6)

表1 各组大鼠大脑皮层及海马TUNEL 的IRS(±s, n=6)

注:与假手术组比较, #P ＜0.05, ##P ＜0.01

组别 大脑皮层 海马假手术组 4.83±1.35 6.47±2.75一次注血组 9.07±1.15## 9.67±2.34#二次注血组 9.53±0.60## 10.67±1.23#

图3 大鼠大脑皮层及海马组织中的TUNEL 染色(×400倍), D 为皮层;E 为海马;1、2、3 分别表示假手术组、一次注血组、二次注血组

2.5 Bax 、Bcl-2 在大脑皮层及海马组织中的表达水平 枕大池一次注血组及二次注血组中Bax 在大脑皮层及海马组织中的表达均较假手术组显著增加(P＜0.01),但两者间差异无显著性(P＞0.01)。注血组Bcl-2 的表达均较假手术组显著下降(P＜0.01),表2,图4)。

表2 各组大鼠大脑皮层及海马Bax、Bcl-2的IRS(±s, n=10)

表2 各组大鼠大脑皮层及海马Bax、Bcl-2的IRS(±s, n=10)

注:与假手术组比较, #P＜0.01

组别大脑皮层 海马Bax 的IRS Bcl-2 的IRS Bax 的IRS Bcl-2 的IRS假手术组 0.59±0.30 1.64±0.31 0.56±0.26 1.17±0.51一次注血组 1.43±0.43# 0.42±0.29# 1.13±0.48# 0.24±0.29 #二次注血组 1.75±0.37# 0.24±0.14# 1.16±0.45# 0.10±0.08 #

3 讨 论

图4 F1-3、G1-3 分别表示Bax 在假手术组、一次注血组、二次注血组大鼠大脑皮层及海马组织中的免疫组化染色;H1-3、I1-3 分别为Bcl-2 在3 组大鼠大脑皮层及海马组织中的免疫组化染色(×400 倍)

SA H 是临床上较为常见的脑卒中类型,在中国每年每10万人中约有2 人发生SAH[3],发病初期致死率约为40%,30%的幸存者会有神经和认知功能障碍。SAH 后由于急性颅内压增高和蛛网膜下腔沉积的血块可造成脑血流的急剧降低,如不能得到及时治疗,将不可避免地发生急性全脑缺血,幸存者会造成记忆与认知功能障碍[4]。

在选取SAH 后24 h 这一实验点进行研究后发现,一次注血组及二次注血组的大鼠基底动脉横截面积均较假手术组减小,说明一次注血后24 h 及二次注血后24 h 大鼠的基底动脉均发生了痉挛,但程度不一,二次注血后似更为严重。另外,注血组基底动脉亦出现了如血管内膜增厚、皱褶、细胞层数增多等病理变化,CVS 在SAH 后早期即可出现,其所致的早期脑损伤(Early brain injury, EBI)不容忽视。有学者认为EBI 可能是SAH 患者病死率较高的首要原因[5]。Zhang 等指出EBI 是SAH 早期致死致残的主要原因。其中神经细胞和血管内皮细胞的凋亡起了重要作用[6]。本研究结果表明,注血组大脑皮层及海马凋亡阳性细胞数显著增多。

细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调腔。Bcl-2 家族在细胞凋亡调控中起着重要作用,主要包括两类:一类抑制细胞凋亡,如Bcl-2、Bcl-X(L)等;另一类促进细胞调亡,如Bax、Bid、Bad 等。Bax是促凋亡蛋白,通过激活一系列下游基因发挥促凋亡作用,Bcl-2 蛋白通过抑制细胞色素C 释放,而抑制酶联反应而保护细胞凋亡[7]。Bcl-2 及Bax 的相对比值在决定细胞生存或死亡中可能起关键作用[8]。正常情况下Bcl-2/Bax 保持一定比例,若Bax 增加,Bcl-2/Bax 比值降低,则促进细胞凋亡;相反,若Bcl-2 增多,Bcl-2/Bax 比值增大,则抑制细胞凋亡。本研究中注血组Bax 表达水平均较假手术组高, 而Bcl-2 表达水平较假手术组低,说明注血组大鼠脑组织出现较严重细胞凋亡,而二次注血组凋亡细胞数更多,但这是否说明二次注血组大鼠的脑损伤程度更重尚需进一步研究。

通过实验发现注血后24 h 即可出现细胞的凋亡,其又可能是引起早期脑损伤的重要因素,因此干预细胞凋亡,阻止其进一步发展可能是减轻脑损伤的关键,这也为临床治疗SAH 后早期脑损伤提供了新思路。

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4 Sehba FA, Bederson JB.Mechanism s of acute brain injury after subarachnoid hemorrhage.Neurol Res, 2006, 28(4):381-398.

5 郭宗铎,孙晓川,林 斌,等.蛛网膜下腔出血后早期海马MMP-9的表达与海马神经元凋亡的相关性研究.第三军医大学学报,2009,31(1):71-74.

6 Park S, Yamaguchi M, Zhang JH, et al.Neurovascular protection reduces early brain injury after subarachnoid hemorrhage.Stroke, 2004, 35(10):2412-2417.

7 蒋显锋,师睿蔚,王睿智,等.神经生长因子对氧合血红蛋白诱导鼠神经细胞凋亡的作用研究.中华神经外科杂志,2008, 24(12):940-943.

8 吴有志,徐善水.细胞凋亡及其基因调控在脑血管痉挛中的研究.医学综述,2006,12(23):1426-1428.