PA R-1 激活剂对体外培养的脑血管内皮细胞的影响

关景霞 解燕春 周 琴 周 瑜 曾艳平

近来的研究表明,脑出血后血肿释放的凝血酶在脑水肿的发生机制中起重要作用,凝血酶增加血脑屏障通透性是其诱发脑水肿形成的主要机制之一。但凝血酶增加血脑屏障通透性的具体机制尚不清楚,因此本研究主要探讨PAP-1 受体激活剂对体外培养的脑为血管内皮细胞的影响,旨在明确凝血酶增加血脑屏障通透性的径路和具体环节,为临床治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 脑微血管内皮细胞的培养

健康SD 大鼠5 只,雌雄不拘,体重(200±20)g 。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg),断头处死,去头皮,头颅浸入75%乙醇1 min, 超净工作台内取出完整的脑,小心剔除大血管和脑膜。在无菌状态下迅速剥离大脑皮层,放入D-Hanks 液中,漂洗数次后,将其剪碎,移入含有0.25%胰蛋白酶溶液的小瓶中,37 ℃水浴消化20 min,用含有血清的培养基终止消化,置玻璃研磨器内研磨,制成粗悬液,经孔径为100 μm 的不锈钢筛网过滤,滤液以4000 r/min 离心20 min,弃离心后的上清液,沉淀加入15%右旋糖酐。重新悬浮沉淀,以4000 r/min离心20 min,可见溶液分层,收集最下层的微血管片断,0.05%胶原酶消化2 ～4 h, D-Hanks 洗涤并离心后加入生长培养液:M 199 培养基,20%新生小牛血清,肝素25 IU/ml, HEPES 10 mmol/L,青霉素100 IU/ml,链霉素100 μg/ml,接种于100 ml 1次性塑料培养瓶中,5%CO2,37 ℃培养,24 h 后换液,未贴壁的微血管片段,移入其他培养瓶内继续贴壁、生长,以后每3 d 换液1 次。

1.2 内皮细胞的鉴定

采用相差显微镜下观察细胞形态和Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学方法进行鉴定。

1.3 SFLLRN 对内皮细胞形态影响的观察

在内皮细胞培养液中加入SFLLRN 2 μg 或凝血酶5 U,相差显微镜下随机选取5 个视野,每个视野随机选取10 个细胞,应用显微测量尺测量细胞的长度、宽度,计算细胞的面积,进行分析处理。

1.4 MM P-2 蛋白免疫组织化学技术

免疫组织化学技术采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(stret-avidin-biotin-enzyme complex, SABC)法,兔法大鼠MM P-2 多克隆抗体工作液浓度为1∶100,具体步骤参照操作说明书进行。在200 视野下,随机选取20 ～30 个微血管内皮细胞,用TJ T Y2300 型全自动图像分析仪测定细胞内产物的平均光密度值(OD 值),进行分析处理。

1.5 统计学处理 采用SPSS 统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(±s)表示,显著性水平α=0.05,组间比较采用t 检验。

2 结 果

2.1 内皮细胞的鉴定

2.1.1 形态学观察

倒置显微镜下观察到获得的微血管片段多为数个或十几个细胞组成反光较强的片段,其表面较为粗糙,偶见较粗或较长的血管片段,24 h 换液后,大部分微血管片段贴壁,细胞体积逐渐增大,并逐渐收缩为细胞团,2 d 后可见细胞团内细胞有伪足伸出,并开始分裂增殖,7 d 以后即可形成多个片状单层生长的细胞。此时可观察到两种形态的细胞,其中一种体积小,呈短梭形,胞质反光强,数量较少。另一种细胞体积较大,呈多角形,胞质丰富。有一个至数个核仁,数量较多(图1)。

2.1.2 Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色

细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色呈阳性,棕黄色的颗粒均匀地分布在整个细胞质,苏木素复染后,细胞核呈蓝色(图1)。

图1 脑微血管内皮细胞的鉴定 A 为原代培养的脑微血管内皮细胞(倒置显微镜×200 倍);B 为Ⅷ因子免疫组织细胞化学染色(DAB×200 倍)

2.2 SFLLRN 对内皮细胞形态的影响

细胞培养液中加入SFLLRN 后1 h 可观察到内皮细胞开始收缩,面积变小,细胞间隙增宽,随着时间的延长,细胞收缩的程度逐渐加大,至12 h 细胞面积只有原来面积的20%。凝血酶组细胞形态的变化方式与SFLLRN 组相似,在各个时间点两组比较差异均无显著性(P＞0.05)(图2,3)。

图2 SFLLRN 孵育后内皮细胞的形态的变化(倒置显微镜×200 倍) A 为SFLLRN 孵育前内皮细胞的形态;B 为SFLLRN 孵育后12 h 内皮细胞的形态

2.3 SFLLRN 对内皮细胞M M P-2 表达的影响

对照组可见较低水平的M MP-2 蛋白表达,细胞染色较淡,主要位于细胞核周围的胞质。SFLLRN 加入细胞培养液6 h 后可见M MP-2 蛋白表达明显增加,细胞颜色及颗粒密度加深,棕黄色的颗粒均匀地分布在整个细胞质,与对照组比较差异具有显著性。SFLLRN 组与TM 组比较,M M P-2 蛋白的表达无明显差异(图4,5)。

图3 SFLLRN 加入培养液后细胞大小的动态变化

图4 SFLLRN 孵育后内皮细胞MMP-2 蛋白表达 与对照组比较, *P ＜0.05, **P ＜0.01

图5 内皮细胞MM P-2 蛋白免疫组织化学染色 A 为对照组(孵育24 h DAB×200 倍;B 为SFLLRN 组(孵育24 h DAB×200 倍)

3 讨 论

凝血酶是一种血清丝氨酸蛋白酶,由无活性的凝血酶原产生,催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白,是凝血级联反应过程中的关键酶。随着研究的不断深入,人们对凝血酶又有了新的认识。凝血酶是一种重要的细胞外信号分子,通过激活凝血酶受体,参与一系列的病理过程[1,2]。凝血酶受体是一种蛋白酶活化受体(protease activated receptor, PAR)。目前,已有4 种凝血酶受体的cDNA 被克隆,其中PAR-1, PAR-2, PAR-3 的基因位于5q13, PAR-4的基因位于19p12[3,4]。PAR-1, PAR-3, PA R-4 主要由凝血酶激活, PAR-2 主要由胰蛋白酶激活,PAR-1 在脑内介导的作用最主要,分布最广泛,凝血酶的大部分生物活性都是通过PAR-1 介导。

脑出血后血液在凝固过程中产生大量的凝血酶对周围组织有毒性作用。大量的研究表明,凝血酶在脑出血后脑水肿的发生机制中起重要作用[5,6]。凝血酶增加血脑屏障通透性是其诱发脑水肿形成的主要机制之一, PA R-1 受体抑制剂可抑制凝血酶对血脑屏障通透性的影响,研究也表明脑微血管内皮细胞上存在密集的PA R-1 受体[7,8], 因此凝血酶对血脑屏障通透性的影响可能是通过PAR-1 受体介导的,因此本研究主要探讨PAR-1 激活剂对体外培养的脑微血管内皮细胞的影响,旨在明确凝血酶破坏血脑屏障的具体径路和作用环节。

血脑屏障的结构基础是脑微血管内皮细胞及其紧密连接,这是血液与脑组织间第一道屏障,围绕在微血管内皮细胞外的基底膜和细胞外基质具有连续性,这是血液与脑组织间第二道屏障。其中基底膜和细胞外基质对微血管起支撑作用,基底膜和细胞外基质的降解,在一定程度上决定血脑屏障的完整性。当微血管内皮细胞、基底膜或细胞外基质受到损伤时,血液中的蛋白质等物质就会大量渗到细胞外间隙,导致水分在细胞外间隙的潴留,从而发生血管源性脑水肿[9]。

SFLLRN 是由丝-苯丙-亮-亮-精-天冬酰胺组成的短肽,是PA R-1 受体激活剂。本研究发现在体外培养的脑微血管内皮细胞培养液中加入SFLLRN后,可引起内皮细胞收缩,细胞面积变小,细胞间隙增大。凝血酶加入细胞培养液后,细胞形态的变化方式与SFLLRN 组相似,在各个时间点两组之间均无明显统计学差异,说明凝血酶通过PAR-1 受体作用于内皮细胞,导致内皮细胞收缩,细胞间隙增宽,在体内可能造成细胞紧密连接的开放,导致血脑屏障通透性增加和血管源性脑水肿。

本研究表明SFLLRN 能够诱导内皮细胞M MP-2 蛋白的表达,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MM P)是一组含Zn2+能解降细胞外基质的蛋白酶,在基底膜降解中起主要作用,通常在中性条件下发挥生物活性。自20 世纪80 年代初研究该酶类到现在发现16 种MM P,构成M MPs 超家族,一旦MM P-2 全部被激活,能够降解所有的细胞外基质,由于MM P 作用的底物不同,因而参与不同的病理生理过程。其中MM P-2 与BBB 通透性关系最密切。MM P-2 主要底物包括明胶,胶原(Ⅳ,Ⅴ, Ⅶ , Ⅹ),层黏连蛋白,弹性蛋白,纤黏蛋白。脑微血管基底膜的主要成分为胶原Ⅳ型、层黏连蛋白、纤黏蛋白,因此M M P-2 的激活可导致基底膜的降解[10]。研究表明脑出血后M MP-2 表达明显增加,MM P-2 通过破坏基底膜和细胞外基质开放血脑屏障而引起脑水肿。M M P-2 抑制剂可明显抑制脑出血后脑水肿,说明M M P-2 与脑出血后脑水肿形成有关[11]。本研究发现SFLLRN 能够诱导内皮细胞MM P-2 蛋白的表达,而且与凝血酶组比较,无明显统计学差异,说明凝血酶通过PAR-1 受体作用于内皮细胞,诱导MM P-2 蛋白的表达。

综上所述,凝血酶通过PA R-1 受体作用于内皮细胞,一方面使内皮细胞发生收缩,细胞间隙增宽。细胞间紧密连接开放,导致血脑屏障通透性增加;另一方面激活MM P-2,降解基底膜和细胞外基质,导致血脑屏障通透性增加。因此PAR-1 受体抑制剂、MM P-2 抑制剂的应用有可能成为治疗脑出血后脑水肿的新手段。

1 Xue M, Fan Y, Liu S, et al.Contributions of m ultiple proteases to neurotoxicity in a m ouse model of intracerebral haem orrhage.Brain, 2009, 132(Pt 1):26-36.

2 Nakam ura T , Kuroda Y, H osomi N, et al.Serine protease inhibitor attenuates intracerebral hemor rhage-induced brain injury and edem a form ation in rat.Acta Neurochir, 2010, 106(Suppl):307-310.

3 Zheng GQ, Wang XT, Wang XM, et al.Long-tim e course of protease-activated receptor-1 expression after intracerebral hemorrhage in rats.Neurosci Lett, 2009, 459(2):62-65.

4 Striggow F, Riek-Burchardt M , Kiesel A, et al.Four different types of protease activated receptors are w idely expressed in the brain and are up-regulated in hippocampus by severe ischemia.Eur J Neurosci, 2001, 14(4):595-608.

5 H ua Y, Keep RF, H off JT, et al.Brain injury after intracerebral hemorrhage:the role of throm bin and iron.Stroke, 2007,38(2 Suppl):759-762.

6 Ohnishi M, Katsuki H , Fujim oto S, et al.Involvement of thrombin and mitogen activated protein kinase pathways in hemorrhagic brain injury.Exp Neurol, 2007, 206(1):43-52.

7 Bartha K, Dom otor E, Lanza F, et al.Identification of thrombin receptors in rat brain capillary endothelial cells.J Cereb Blood Flow Metab, 2000, 20(1):175-182.

8 Kim YV, Di Cello F, H illaire CS, et al.Differential Ca2+signaling by thrombin and protease-activated receptor-1-activating peptide in human brain microvascular endothelial cells.Am J Physiol Cell Physiol, 2004, 286(1):C31-42.

9 Keep RF, Xiang J, Ennis SR, et al.Blood-brain barrier function in intracerebral hemorrhage.Acta Neurochir, 2008, 105(Suppl):73-77

10 Wang J, Tsirka SE.Neuroprotection by inhibition of matrix metalloproteinases in a mouse m odel of intracerebral haemorrhage.Brain, 2005, 128(Pt 7):1622-1633.

11 Li Y, Ogle ME, Wallace GC, et al .E ry thropoietin attenuates intracerebral hemo rrhage by diminishing matrix m etalloproteinases and maintaining blood-brain barrier integrity in mice.Acta Neurochir, 2008, 105(Suppl):105-112.