福建沿海臭鼩鼱感染巴尔通体调查研究*

臭鼩鼱(Suncusmurinus)属食虫目,鼩鼱科,常居于室内外阴湿处,近年来福建沿海地区臭鼩鼱密度有上升趋势,且局部地区已在鼠形动物中形成优势种群〔1〕。为了解福建沿海鼠形动物优势种群臭鼩鼱感染巴尔通体情况及分布,掌握臭鼩鼱作为保存宿主感染的巴尔通体种属,2006～2008年,我们开展了福建沿海6市臭鼩鼱中巴尔通体流行状况的调查并作基因特征分析,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 调查点选择 以福建省行政区划为依据在沿海宁德、福州、莆田、泉州、厦门、漳州6地级市中各随机抽取1个市(区)作为调查点,他们分别是蕉城区、福清市、荔城区、南安市、海沧区和龙海市。各调查点内选择不同地理景观和不同生境作为鼠笼布放点。

1.2 样本采集保存 各调查点于每年4～9月采用笼d法捕鼠,无菌状态经鼠股动脉采样,液氮保存。1.3 培养与分离 分离方法参照美国报道方法〔2〕,并经本实验室改良而来〔3〕,简述如下：取血样在1∶4BHI中稀释液涂布于5%兔血琼脂平板中,在5%CO2培养箱中36℃、RH85%中培养1～6W 后,可见圆形凸起,经BASO刘氏染色后,在油镜下,可见极其微小杆菌或球杆菌,作为疑似菌待作下一步实验。

1.4 PCR扩增对可疑巴尔通体菌株,使用煮沸法提取染色体DNA,制成模板后,-20℃保存备用。聚合酶链式反应(PCR)采用的引物是具有巴尔通体属水平特异性的引物(BhCS781.p-BhCS1l37.n),扩增枸橼酸合酶基因(gltA)的379bp片段以证实是否巴尔通体。上游引物BhCS781.p碱基序列为：5'-GGG GAC CAG CTC ATG GTG G-3',下游引物BhCS1l37.n碱基序列为：5'-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3'。PCR反应体系总量为μ l,含以下成分：北京天为时代科技有限公司的Pfu MasterMixp 17μ l,正向、反向引物各 1μ l,模板1μ l。扩增程序为95℃2min,48℃30s,72℃30s,再按94℃30s,48℃30s,72℃30s行30个循环,72℃延伸5min结束。取 6μ l PCR扩增产物于1.5%的琼脂糠凝胶经80～100V 40min电泳,设标准分子量(Marker,50bp Ladde),阴性对照(用去离子水代替模板)。

1.5 序列分析 本研究设计引物TILE.455P-TALA.885.n扩增产物为核苷酸序列由上海生物工程技术服务公司测定。网上利用核苷酸序列对比程序BLAST2.0,与Genbank中注册的核苷酸序列进行同源性比较。用DNASTA软件进行双序列同源性比对。用 Neighbor-Jouning tree(NJ)法建树,采用Bootstrap验证(n=1000)。

2 结 果

2.1 臭鼩鼱在鼠形动物中构成 本次调查共捕获鼠形动物1161只,其中臭鼩鼱 294只,占 25.33%,与褐家鼠、黄胸鼠构成福建沿海地区鼠形动物优势种群,见表1。

2.2 巴尔通体分离 2006～2008年,共从6个采样点捕获臭鼩鼱294只,从中分离出疑似菌株,经PCR证实,有63株为巴尔通体。巴尔通体细菌学性状、gltA扩增产物及电镜形态见图1～3。

2.3 地区及鼠间分布 臭鼩鼱感染巴尔通体,感染率21.43%,分布在福建沿海各地市中,见表2。且臭鼩鼱感染率(21.43%)高于黄胸鼠(18.27%)、褐家鼠(13.54%)及其它鼠种(10.87%),χ2=10.781,P＜0.05。见表3。

表1 福建沿海6市鼠形动物构成(2005-2008年)Table 1 Constituent ratio of rodent from six investigated districts of Fujian coastal region(2005-2008)

图4 福建省沿海巴尔通体系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Bartonella species from Fujian coastal region

2.4 基因特征与地域/宿主的关系

2.4 基因特征与地域/宿主的关系 在沿海6市(区)63株臭鼩鼱巴尔通体菌株中随机抽取19株作gltA基因的379bp片段序列测定。序列分析表明,巴尔通体感染臭鼩鼱明显的种群分布特征和地域分布特征。福建省共从鼠形动物中检出：B.elizabethae、B.qeenslandensis和B.tribocoram三种巴尔通体,而臭鼩鼱仅携带B.tribocoram种,且厦门海沧16株均感染B.tribocoramB亚群,福清1株感染B.tribocoramB亚群,而南安2株均感染B.tribocoramA亚群(图 4)。

3 讨 论

臭鼩鼱是南亚热带气候区的主要鼠形动物之一,且随着气温的提高,福建省近十年来臭鼩鼱的数量有明显上升趋势,每年的3～4、9～10月份占有绝对优势〔1〕。本调查虽未连续观测臭鼩鼱的月动态变化,但其占室内鼠形动物的25.33%,比重不小。因此,研究臭鼩鼱感染巴尔通体的流行状况很有必要。

本文首次描述了臭鼩鼱感染巴尔通体的流行与分布特征,证实它是巴尔通体的保存宿主,从而填补了巴尔通体在食虫目鼩鼱科动物中流行状况的空白。从249份臭鼩鼱血样中共分离到63株巴尔通体,分离率达21.43%,菌株在福建沿海各市(区)臭鼩鼱均有分布,表明巴尔通体在臭鼩鼱广泛存在,重度流行,预防控制巴尔通体应将臭鼩鼱列入重点对象。

系统发育发析表明闽东南沿海臭鼩鼱巴尔通体仅为B.tribocoram种A、B两个亚群,该型巴尔通体为Heller等〔4〕首先从法国褐家鼠分离得到,且地域分布特征明显。本研究再次证实了此观点,海沧、福清17株均为Tirtocorum.B,而南安2株均为B.tribocoramA。有鉴于此,对于臭鼩鼱感染巴尔通体种型与地理景观及其生存环境的关联还有待进一步调查研究。

(感谢蕉城区、福清市、荔城区、南安市、龙海市疾病预防控制中心同仁参加样本采集。)

表2 福建沿海6市臭鼩鼱中巴尔通体感染的感染率Table 2 Infection rate of Bartonella in Suncus murinus from six investigated districts of Fujian coastal region(%)

表3 福建沿海6市鼠形动物巴尔通体感染率(2005-2008年)Table 3 Infection rate of Bartonella in rodent from six investigated districts of Fujian coastal region(%)(2005-2008)

〔1〕周淑恒,陈亮,李述杨,等.福建臭鼩鼱种群数量分布调查〔J〕.海峡预防医学杂志,2003,9(5)：37-38.

〔2〕Kosoy M,regnery R,T sianbosT,et al.Distribution,diversity and host specity ofBartonallain rodents from the southeastern United States〔J〕.Am J Trop Med Hyg,1997,57 ：578-588.

〔3〕叶曦,姚美琳,李国伟.福建省鼠形动物巴尔通体感染调查〔J〕.中国人兽共患病学报,2006,22(8)：779-781.

〔4〕Heller R,Rieg ler P,Hansmann Y,et al.Bartonella tribocoramsp.nov,a newBartonellaspecies is olated from the blood of wild rats〔J〕.International Journal of Systematic Bacteriology,1998,48：1333-1339.