原位吸附和茉莉酸甲酯联合使用显著提高中国红豆杉细胞云南紫杉烷c的生产

高明波，张卫，虞星炬

1 中国科学院大连化学物理研究所 海洋生物产品工程组，大连 116023 2 中国科学院研究生院，北京 100049 3 大连民族学院生命科学学院，大连 116600 4 澳大利亚Flinders大学 海洋分子生物过程及生物产品实验室，阿德莱德 SA 5042

原位吸附和茉莉酸甲酯联合使用显著提高中国红豆杉细胞云南紫杉烷c的生产

高明波1,2,3，张卫1,4，虞星炬1

1 中国科学院大连化学物理研究所 海洋生物产品工程组，大连 116023 2 中国科学院研究生院，北京 100049 3 大连民族学院生命科学学院，大连 116600 4 澳大利亚Flinders大学 海洋分子生物过程及生物产品实验室，阿德莱德 SA 5042

本实验所用的中国红豆杉细胞悬浮培养体系中，云南紫杉烷c(Tc)是主要的次生代谢产物，该化合物有类神经生长因子活性，提高其产量是进一步规模化生产的前提。本研究考察了原位吸附和茉莉酸甲酯(MJA)联合调控提高Tc产量的可能性。在培养的第7天加入浓度为100 µmol/L的MJA虽然会使细胞的生物量下降10%～30%，但是单位细胞内Tc含量和Tc产量均有显著提高，分别是对照的3.6和3.3倍。吸附剂XAD-7在不同时间加入对Tc 的合成影响显著。在培养的第7天同时加入100 µmol/L的MJA和100 g/L的XAD-7会使细胞生物量增加，Tc产量显著提高。培养到第21天，Tc产量达477.4 mg/L，为对照的6.3倍，为只加MJA的1.9倍，其中94%的Tc被树脂吸附。实验结果表明，在MJA诱导高表达的过程中，吸附剂XAD-7的加入使细胞内代谢产物外泌，浓度降低，减轻产物反馈抑制现象，从而大幅度提高代谢物产量，有较好的生产前景。

中国红豆杉，细胞悬浮培养，茉莉酸甲酯，XAD-7，云南紫杉烷c

Abstract:A bioprocess intensification strategy that combines both elicitation and in situ absorption was developed to improve the production of taxuyunnanine c(Tc)in cell suspension cultures of Taxus chinensis.When 100 µmol/L methyl jasmonate was added as an elicitor on Day 7, the Tc content and yield increased 3.6 and 3.3 times respectively, however the cell growth was reduced by 10%−30%.Significant improvement in Tc yield was observed when an absorbent XAD-7 was added on different time of the cultureperiod.The optimum Tc yield was achieved when 100 g/L XAD-7 was added simultaneously with 100 µmol/L methyl jasmonate on Day 7.The maximum Tc yield of 477.4 mg/L was obtained on Day 21 of the culture, being 6.3-fold of the control and 1.9-fold of the 100 µmol/L methyl jasmonate treatment alone.In the combined treatment, 94% of the Tc produced was secreted outside of the cells and absorbed on XAD-7 absorbents.The results demonstrated that the process strategy combining elicitation and in situ absorption was effective to intensify the Tc biosynthesis via elicitation with the removal of product feedback inhibition via absorption,presenting a great potential in commercial applications.

Keywords:Taxus chinensis, cell suspension culture, methyl jasmonate, XAD-7, taxuyunnanine c

植物细胞培养是生产有价值次生代谢产物的一条有效途径，但商业化成功的例子只有紫草细胞生产紫草素[1]、人参细胞生产人参皂甙[2]等有限几个体系，其主要原因是植物细胞次生代谢物产率和产量均太低，远远达不到工业化生产的要求[3-4]。因此，采用各种调控手段提高次生代谢物的生产一直是植物细胞研究领域的一个热点[5]。

紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的一线用药，是迄今为止少数几个最具抗癌活性的天然化合物之一[6]。紫杉醇的发现激励科学家投身到紫杉烷类化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉烷类化合物[7]。已经有几百种紫杉烷从紫杉原植物或细胞培养液中被分离出来[8]。例如在中国红豆杉细胞培养中可大量生产云南紫杉烷c(Tc)，Tc是一种具有类神经生长因子活性的新化合物[9]。为提高紫杉醇和紫杉烷类化合物的产量，目前在摇瓶或生物反应器水平已经开发出很多提高目标代谢物产量的技术[10-14]。

诱导子的筛选和使用是应用最广泛并取得显著效果的一个策略。在众多诱导子中，茉莉酸(JA)及其甲酯(MJA)作为一种植物体内防御体系的信号转导子，在提高各种紫杉细胞株紫杉醇及紫杉烷产量上被证明为一个效果显著的诱导子[15-16]。研究认为，紫杉醇和紫杉烷贮存于胞内，可能在细胞壁上[17-18]。使用吸附剂原位吸附技术如能促进胞内代谢物外泌，将因吸附产物解除产物的反馈抑制而有利于提高产量；同时也可使目标代谢产物纯化，便于分离。Kwon等报道过在紫杉细胞培养第16天加入非离子交换树脂Amberlite XAD-4会使紫杉醇产量提高40%～70%[19]。Komaraiah在Plumbago rosea(白丹花)细胞固定化培养生产plumbagin(蓝雪醌)时联合使用壳聚糖和XAD-7取得了理想的效果[20]。Choi 在高山唐松草细胞培养中，使用膜包裹的XAD-7选择性吸附黄连素，使之与多巴胺分离[21]。但因为XAD在添加和培养后与细胞分离方面遇到的困难，有关这项技术的报道很少[5]。

本实验选用有效提高植物次生代谢产物生产的MJA作为诱导子，以非离子交换树脂XAD-7为吸附剂，考察两种策略联合使用对中国红豆杉细胞Tc生产的影响。

1 材料与方法

1.1 诱导子和吸附剂

MJA购自Sigma Aldrich；Amberlite XAD-7 购自北京慧德易科技有限责任公司。

1.2 细胞株和传代培养条件

细胞株由华东理工大学钟建江教授提供，在本实验室传代培养1年。该细胞系由中国红豆杉Taxus chinensis幼茎诱导的愈伤组织悬浮培养而来，已经培养了10余年。该细胞系的传代培养基为：MS基础培养基，附加0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L NAA、100 mg/L Vc和30 g/L 蔗糖。高压灭菌前pH调至5.8。115℃灭菌15 min。传代细胞每2周传1次，在500 mL 三角瓶中装100 mL 培养基，传代时将种子细胞经50 µm筛网过滤，细胞接种密度100 g/L。三角瓶以双层铝箔纸封口，置于100 r/min摇床上，(25±1)℃暗培养。

1.3 MJA的添加

有文献报道，MJA在细胞培养的第 7天以100 µmol/L的浓度加入对紫杉细胞紫杉烷的生产最有利，因此本实验选择在第7天以100 µmol/L的浓度加入MJA，考察中国红豆杉细胞对其响应情况。在生物安全柜内，取培养14 d的中国红豆杉种子细胞，经50 µm筛网过滤，精密称取2 g过滤后的湿细胞接种至盛装20 mL上述传代培养基的100 mL三角瓶中，100 r/min摇床上，(25±1)℃暗培养。培养至第 7天，向培养基中添加 MJA。事先以无水乙醇为溶剂配好的100 mmol/L MJA经0.22 µm PVDF膜过滤除菌，按照1 µL诱导子/mL 培养基的量加入到培养基中，MJA在培养基中的浓度为100 µmol/L。对照组加入等量的无水乙醇。培养后第21天取样分析。

1.4 XAD-7的预处理

非离子交换树脂Amberlite XAD-7 在使用前以分析纯甲醇浸泡24 h，中间更换2次甲醇，然后真空抽滤，以重蒸水冲洗多次，115℃高压灭菌15 min，备用。

1.5 XAD-7在不同培养时间添加

文献中XAD-7通常的使用量为50～100 g/L，本实验采用100 g/L。取培养14 d的中国红豆杉种子细胞，接种方法和培养条件同上。分别向培养0 d、7 d和12 d的细胞中加入100 g/L XAD-7。细胞培养的第7天加入MJA，使其浓度为100 µmol/L，方法同上，对照加入对应体积的无水乙醇。培养后第21天取样分析。

1.6 生物量测定

将取样细胞悬浮培养液真空抽滤，用重蒸水冲洗 3次，洗去细胞上残留的培养基，称重得细胞鲜重，以FCW(Fresh cell weight)(单位：g/L)表示。鲜细胞在50℃烘箱中烘48 h至恒重，称量可得细胞干重，以DCW(Dry cell weight)(单位：g/L)表示。生物量取样时间为第7、12、15和21天。

1.7 XAD-7和细胞的分离

加入XAD-7培养的细胞，取样时先让三角瓶静置片刻，由于密度差，细胞和XAD-7会自然分层，细胞在上层。另取干净三角瓶，小心将细胞倒出。分至细胞和树脂界面时停止，加入少量重蒸水，使细胞和树脂重新分层，如此重复多次，即可使细胞和树脂完全分开。

1.8 Tc的提取和分析

Tc的提取和分析方法参考Qian等[22]的方法。

1.8.1 Tc的提取

取100 mg细胞干粉(或250 mg XAD-7)加入20倍体积分析纯甲醇，室温静置提取48 h，超声2次，每次40 min。提取液经4000 r/min离心10 min，上清液转入另一干净离心管内。残渣以20倍体积分析纯甲醇再提取1次。将2次提取液的上清合并，25℃减压旋转蒸发。干粉加入2 mL 二氯甲烷和2 mL重蒸水，充分混匀，4000 r/min离心10 min，上层为水层，以吸管吸净弃掉。下层为二氯甲烷层，25℃减压旋转蒸发。干粉溶于1 mL色谱纯甲醇，经0.22 µm有机滤膜过滤，用于HPLC分析。

1.8.2 Tc的分析

HPLC分析系统为Agilent 1100系列，色谱柱为Alkyl Phenyl 5 µm(4.6 mm×250 mm)(中国科学院大连化学物理研究所103组)。检测波长227 nm，柱温25℃，进样量10 µL，流动相为：58%乙腈：42%水(V/V)，流速1.0 mL/min。

1.8.3 Tc含量、吸附率和产量的计算

Tc含量以单位干细胞的 Tc量计(单位：mg/g细胞)，Tc吸附率以单位树脂内吸附的 Tc量计(单位：mg/g树脂)；Tc产量以单位干细胞Tc含量乘以细胞干重计(单位：mg/L)。

2 结果和分析

2.1 MJA为诱导子对细胞生长和 Tc生产动力学的影响

如图1所示，MJA的加入对中国红豆杉细胞的生物量有显著的影响，在整个细胞生长周期内细胞鲜重和干重均有一定幅度的下降，下降幅度在 10%～30%左右。

实验中测定了培养基中Tc的含量，含量甚微，未计在内。虽然MJA的加入减少了中国红豆杉细胞生物量的积累，但是却大大提高了单位干细胞内的Tc含量(图2A)。在培养的第21天，单位干细胞Tc含量达到25.2 mg/g DCW，为对照的3.6倍。这样就弥补了MJA加入后细胞生物量的下降对Tc产量的负影响。Tc产量在细胞培养的第21天达到249 mg/L，为对照的3.3倍(图2B)。

2.2 XAD-7在不同时间加入的影响

第7天加入浓度为100 µmol/L的MJA对中国红豆杉细胞Tc的含量和产量均有显著的促进作用，后面的实验除对照外，均在第7天加入MJA，使其在培养液中的浓度为100 µmol/L。

图1 MJA对中国红豆杉细胞鲜重(A)和细胞干重(B)的影响Fig.1 Effects of MJA on fresh cell weight(A)and dry cell weight(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

MJA和不同时间加入的 XAD-7联合使用对中国红豆杉细胞生长的影响如图3所示。在第7天加入MJA的同时若加入浓度为100 g/L的XAD-7，中国红豆杉细胞的鲜重和干重不仅没有被抑制，反而有一定程度的提高。第 0天加入 XAD-7 会严重抑制细胞的增长，生物量在加入树脂后的2周内基本没有增加。第12天加入XAD-7也会使细胞生物量受到抑制，细胞鲜重和干重下降幅度在40%～50%。

图4为XAD-7在不同时间加入后，在培养的第21天，单位干细胞内Tc含量(图4A)及XAD-7 Tc吸附率(图4B)的情况。可以看出加入XAD-7后，单位细胞内Tc含量均明显下降；XAD-7 Tc吸附率以第7天加入时最高。到第21天，单位体积培养液内的树脂吸附的Tc已达到448.1 mg/L，如图5所示。

图2 MJA对中国红豆杉细胞中Tc含量(A)和Tc产量(B)的影响Fig.2 Effects of MJA on Tc content(A)and Tc yield(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

图3 MJA和不同时间添加的XAD-7对中国红豆杉细胞生长的影响：(A)细胞鲜重和(B)细胞干重Fig.3 Effects of MJA and XAD-7 on fresh cell weight(A)and dry cell weight(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

图4 MJA和不同时间添加的XAD-7对中国红豆杉细胞(A)单位干细胞Tc含量和(B)XAD-7 Tc吸附率的影响Fig.4 Effects of MJA and XAD-7 on Tc content(A)and Tc absorption rate(B)in the suspension cultures of Taxus chinensis.

图5 MJA和不同时间添加的XAD-7对中国红豆杉细胞Tc产量及胞内外分配的影响Fig.5 Effects of MJA and XAD-7 on Tc production and distribution in the suspension cultures of Taxus chinensis.1:XAD-7 added on Day0; 2: XAD-7 added on Day7; 3: XAD-7 added on Day12.

不同时间加入XAD-7后，Tc总产量的变化情况及胞内外分配情况见图5。第7天加入100 g/L XAD-7和MJA的联合作用最为显著，使Tc产量第21天达到477.4 mg/L，为对照的6.3倍，为只加MJA的1.9倍。其中94%Tc被吸附到树脂中。由图3和图5可见，细胞培养第0天加入XAD-7，细胞生长和生产都处于停滞状态，说明XAD-7对静止期的细胞有很强的毒害作用。而在细胞指数生长初期(第7天)加入的XAD-7可非常有效地将原产胞内的Tc吸附出来，从而大大解除产物的反馈抑制，提高Tc的产量。在细胞代谢高峰期(第12天)加入XAD-7，产物抑制并未解除，后期虽然解除抑制，效果已不突出，从而使Tc产量虽然也有提高，但幅度不大。

3 讨论

产量低是植物细胞培养生产次生代谢物难以实现工业化的主要障碍之一，因此寻求提高植物细胞培养中次生代谢物产量的技术一直是倍受关注的焦点，也开发出了很多有效的技术[23]。但最初筛选得到的细胞株生产水平通常都很低，要想使目标代谢物产量达到工业化水平，只靠一种提高产量的策略难以实现几个数量级的飞跃。2种或2种以上增产策略的联合使用被证明可以协同地获得目标代谢物的高水平[5,24-25]。Zhang等[26]同时使用 3种诱导子，Zhong实验室使用条件培养基和诱导子联合作用[27]，诱导子和蔗糖饲喂联合作用[28]，诱导子、蔗糖饲喂和乙烯利联合作用[29]，Mei实验室有机溶剂萃取和蔗糖饲喂联合作用[30]在提高紫杉醇或紫杉烷产量上都取得了显著效果。

本研究考察了在提高植物细胞次生代谢物产量上具有良好效用的诱导子 MJA和固体吸附剂非离子交换树脂 XAD-7联合使用对中国红豆杉细胞液体悬浮系生长和主要产物Tc产量的影响。实验结果发现，中国红豆杉细胞悬浮系在第 7天加入浓度为100 µmol/L的 MJA时，细胞生物量会下降 10%～30%左右，但单位细胞内Tc含量和Tc产量均有显著提高。XAD-7加入时间的实验均是和第7天加入浓度为100 µmol/L的MJA联合进行的。实验结果表明，第7天同时加入浓度为100 µmol/L的MJA 和100 g/L的XAD-7对中国红豆杉细胞的生长和Tc的生产最为有利。培养的第21天，该处理的Tc产量为477.4 mg/L，为对照的6.3倍，为只加MJA的1.9倍，其中94%的Tc被树脂吸附。本实验说明，在中国红豆杉悬浮培养细胞指数生长初期加入适当浓度的MJA和XAD-7，可以显著提高Tc的产量。Tc产量提高的原因一方面因为诱导子激发的信号传导作用，另一方面是树脂的吸附避免了产物被降解，同时解除了产物的反馈抑制。另外，因为90%以上Tc被吸附到树脂中，也很好地解除了Tc在胞内时对细胞生长的抑制，细胞生物量反而有所增长。

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Enhanced production of taxuyunnanine c in cell suspension cultures of Taxus chinensis by methyl jasmonate elicitation and in situ absorption

Mingbo Gao1,2,3, Wei Zhang1,4, and Xingju Yu1
1 Marine Bioproducts Engineering Group, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China 2 Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China 4 Molecular Bioprocessing and Bioproducts Laboratory, Department of Medical Biotechnology, School of Medicine, Flinders University, Adelaide,SA 5042, Australia

Received:September 29, 2009;Accepted:December 24, 2009

Corresponding author:Wei Zhang.Tel/Fax: +86-411-84379069; E-mail: wei.zhang@flinders.edu.au