薰衣草花抗大鼠心肌缺血再灌注损伤作用

付伟，杨彩玉，刘婷，李德芳，王振华，郑秋生，袁呈山，王春明

（1石河子大学药学院新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子832002；2兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室，兰州730000；3兰州大学生命科学学院，兰州730000）

薰衣草花抗大鼠心肌缺血再灌注损伤作用

付伟1，杨彩玉1，刘婷1，李德芳1，王振华1，郑秋生1，袁呈山2，王春明3

（1石河子大学药学院新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子832002；2兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室，兰州730000；3兰州大学生命科学学院，兰州730000）

为观察传统维药薰衣草花对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤（I／R）是否具有保护作用，采用改良的Langendorff逆行恒压灌流方法，用停灌／复灌方法建立大鼠离体心脏全心I／R损伤模型，采用结扎左冠状动脉方法建立离体心脏局灶I／R模型。通过记录再灌注过程中左室发展压（LVDP）、左心室内压最大上升／下降速率（±dp／dtmax）、冠脉流量（CF）和心率（HR）观察薰衣草花水煎液（LAE）对全心缺血再灌注损伤心脏心功能的影响，测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）和心肌肌酸激酶（CK）水平以及心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平；采用伊文斯蓝和TTC双染法观察薰衣草花水煎液对局灶性I／R损伤面积的影响。结果显示：与模型组相比，LAE预处理能减少心肌梗死面积，明显升高缺血再灌注损伤心脏的左室发展压（LVDP）、左心室内压上升最大速率（＋dp／dtmax）和下降最大速率（－dp／dtmin），并增加冠脉流量（CF）；降低冠脉流出液中与心肌组织损伤相关的LDH和CK水平；升高心肌组织SOD活性，抑制脂质过氧化物MDA的产生。由此可知，薰衣草花对心肌缺血再灌注损伤有一定保护作用，其作用可能与其改善缺血再灌注心肌组织氧化胁迫状态有关。

薰衣草花；水煎液；缺血再灌注损伤；离体心脏

维吾尔族习用惯药材薰衣草系唇形科植物狭叶薰衣草（Lavandula augustifolia Mill．）的干燥地上部分，维吾尔族语名为吾斯提库都斯。维吾尔医认为薰衣草性质为二级湿热，能消散寒气、补胃理脑、燥湿止痛，用于胸腹胀满，感冒咳喘，头晕头痛，心悸气短，关节骨痛等的治疗，另外部颁标准中多个补益心脑的传统维药复方中均含有薰衣草。现代药理研究表明，薰衣草精油具有抑菌、抗炎、抗焦虑、维护心脏自律性反应、清除自由基等活性［1－5］。但传统维药中薰衣草以煎煮方法应用，煎煮过程中精油基本挥发，其有效成分应保留在水煎液中。

本研究依据薰衣草作为传统维吾尔药的适应症，采用离体心脏缺血再灌注损伤模型，考察了薰衣草花水煎液对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 实验动物

健康雄性SPF级 Wistar大鼠，体重250～300 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（新）2003－0002。

1．1．2 实验试剂

薰衣草花（伊帕尔汗公司）；心肌肌酸激酶（CK）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所；2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）、伊文斯蓝为美国SIGMA公司产品；其他试剂均为市售国产分析纯。实验所需溶液均采用Milli－Q Biocel系统制备超纯水配置。

1．2 薰衣草花水煎液的制备

称取100g薰衣草花，加入到圆底烧瓶中，加入300mL的蒸馏水浸泡30min，再加入200mL蒸馏水，加热回流1h，过滤，收集滤液；于滤渣中再次加入300mL蒸馏水，加热回流1h，过滤，收集滤液；于滤渣中继续加入200mL蒸馏水，加热回流0．5h，过滤，收集滤液；将3次滤液合并，55℃减压浓缩为500 mg／mL（按含有生药量计），经0．22μm除菌滤膜过滤除菌，冷藏备用。本研究中薰衣草花水煎液（LAE）浓度均以单位体积内薰衣草花的生药量表示。

1．3 离体心脏缺血再灌注损伤模型复制及指标测定

按课题组已建立方法［6］复制大鼠离体心脏缺血再灌注模型。Wistar大鼠腹腔注射肝素钠500U／kg抗凝，15min后以10%水合氯醛（350mg／kg，ip）麻醉。开胸取心，立即置于4℃K－H液中，轻挤心脏，排出余血，迅速行主动脉逆行插管，将心脏固定于Langendoff灌流装置上，保持自搏心率，以95%O2和5%CO2混合气体充分饱和的K－H缓冲液（pH＝7．4）恒压逆行灌流。在肺动脉圆椎部位剪一小口，以利于K－H液经冠脉循环排出。

离体心脏全心缺血／再灌注损伤模型及分组给药处理如下：剪开左心耳，球囊导管从左心耳插入左心室，球囊内压调至5～10mmHg。球囊导管连接压力换能器，与生物多导仪（PowerLab 4SP）相连，连续记录左心室收缩压（LVSP），以软件自动分析缺血再灌注前后左心室发展压（LVDP）、左室内压最大上升／下降速率（±dp／dtmax）和心率（HR），以计滴器实时记录冠脉流量（CF）。

离体心脏分组处理如下：

1）正常组：以K－H液平衡灌流90min；

2）模型组：以K－H液平衡灌流30min，停灌20 min，再灌40min；

3）薰衣草花水煎液（LAE）组：平衡灌流20 min，改用含50mg／L LAE的K－H液灌流10min，之后停灌20min，K－H液再灌40min。

用生理记录仪记录灌流全过程心功能变化情况，以软件自动分析再灌注15min、30min和40 min时间点各指标情况以反映心功能状况。用恢复率表示，以缺血前20min平均值为100%，再灌注期各时间点换算为缺血前20min的百分率。于再灌注20min和40min收集冠脉流出液，按试剂盒说明书分别测定LDH和CK水平。灌流结束后，迅速取下心脏，剪下左心室，滤纸吸干水分后称重，加入10倍量冰生理盐水后匀浆。匀浆液于10，000g离心10min，收集上清，按试剂盒说明书测定SOD和MDA水平。

离体心脏局灶性缺血／再灌注损伤模型及分组给药处理如下：

1）模型组：以K－H液平衡灌流30min后，以6．0号丝线结扎左冠状动脉前降支，造成局灶缺血30 min，随后松开丝线，再灌注120min。

2）薰衣草花水煎液（LAE）组：平衡灌流20 min，改用含50mg／L LAE的K－H液灌流10min，以6．0号丝线结扎左冠状动脉前降支，造成局灶缺血30min，随后松开丝线，再灌注120min。再灌注结束时，将丝线再次结扎冠状动脉，经灌流针从主动脉注入0．2mL的2%伊文思蓝，用PBS溶液将心脏冲洗后冷冻于－20℃，将心脏切成约1mm厚的薄片，在37℃水浴中再用1%TTC孵育10～15 min。心脏未缺血区被染成蓝色，缺血未坏死区呈深红色，缺血坏死区呈白色。采用Image Pro Plus 5．0图像处理软件，计算未缺血、缺血未坏死和缺血坏死区心肌面积。

1．4 薰衣草花水煎液浓度的选择

利用离体心脏全心缺血／再灌注损伤模型，观察不同浓度的薰衣草花水煎液对再灌注30min时心肌功能LVDP的影响，选择最佳浓度。

1．5 统计学处理

采用SPSS 10．0软件进行统计学处理，实验结果以¯χ±S表示，采用t检验进行组间均值比较，P＜0．05为有统计学意义。

2 结果

2．1 薰衣草花水煎液浓度选择

结果（图1）表明，不同浓度LAE处理后心脏再灌注30min，20mg／L～50mg／L LAE可浓度依赖性增加I／R损伤后LVDP的恢复率，50mg／L时达最大值。但当LAE浓度高于50mg／L时（70mg／L和100mg／L），离体心脏I／R后LVDP恢复率反而随浓度的升高而降低，表明LAE对离体心脏I／R损伤具有双向调控作用。

本研究观察LAE对心脏I／R损伤保护作用，选用50mg／L LAE预处理浓度。LVDP（%）＝再灌注30min时／缺血前20min时×100%，n＝5。

图1 不同浓度的薰衣草花水煎液对I／R的LVDP的影响Fig．1Effect of different concentration lavandula decotion（LAE）on the left ventricular developed pressure（LVDP）in ischemia／reperfusion（I／R）injured isolated rat heart

2．2 薰衣草花水煎液对大鼠离体心脏缺血再灌注心功能的影响

结果见表1。由表1可知：大鼠离体心脏全心缺血再灌注损伤可致各时间点LVDP、±dp／dtmax、CF均明显降低（P＜0．01），HR减慢（P＜0．01）。50mg／L薰衣草花水煎液预处理可明显改善缺血再灌注所致上述的心功能受损情况，促进LVDP和±dp／dtmax的恢复（P＜0．01），对心率的恢复也有一定作用（P＜0．01，30min）（P＜0．05，40min），薰衣草花水煎液预处理可明显增加离体心脏I／R损伤后不同时间点的冠脉流量（P＜0．05）。

2．3 薰衣草花水煎液对局灶性心肌缺血梗死面积的影响

图2a和图2b分别示典型I／R组和薰衣草水煎液处理组结扎左冠状动脉后心肌染色结果。统计结果（图2c）表明，结扎左冠状动脉前降支可造成约50%左心室心肌组织发生缺血再灌注损伤，I／R对照组缺血面积为（55．0±6．32）%，LAE处理组缺血区面积为（53．4±5．54）%，两组未见明显差别；但I／R组心肌组织坏死区面积占缺血区面积的（20．1±3．55）%；50mg／L LAE处理组缺血坏死区仅占缺血区的（10．0±2．54）%，两组比较具有极显著统计学差异（P＜0．01）。说明LAE预处理虽不能减少结扎左冠状动脉前降支所致的缺血发生，但可明显减轻I／R所致心肌组织坏死。

表1 薰衣草花水煎液对大鼠离体心缺血再灌注心功能的影响¯χ±S，n＝8Tab．1Effects of lavandula decotion（LAE）on myocardial function during reperfusion in isolated rat heart

图2 薰衣草花水煎液对局灶性缺血再灌注损伤所致心肌梗死面积的影响Fig．2Protective effect of lavandula decotion（LAE）on myocardial infarct size

2．4 薰衣草花水煎液对缺血再灌注损伤大鼠离体心脏冠脉流出液CK和LDH水平的影响

结果见表2。

由表2可见，停灌前各组冠脉流出液中CK和LDH水平均与正常组相当，再灌注后，I／R组冠脉流出液中CK和LDH水平明显升高（P＜0．01vs正常组），50mg／L薰衣草花水煎液处理后，冠脉流出液中CK和LDH水平明显降低（P＜0．05vs I／R组）。这表明薰衣草花水煎液能够对缺血再灌注所致心肌细胞损伤有保护作用。

表2 薰衣草花水煎液对缺血再灌注损伤大鼠离体心脏冠脉流出液CK和LDH活性的影响，n＝8Tab．2Effect of lavandula decotion（LAE）on the activities of creatine kinase（CK）and Lactate dehydrogenase（LDH）in coronary flow liquid after ischemi－reperfusion（I／R）injury

表2 薰衣草花水煎液对缺血再灌注损伤大鼠离体心脏冠脉流出液CK和LDH活性的影响，n＝8Tab．2Effect of lavandula decotion（LAE）on the activities of creatine kinase（CK）and Lactate dehydrogenase（LDH）in coronary flow liquid after ischemi－reperfusion（I／R）injury

注：与正常组比较，a表示P＜0．01；与模型组比较，b表示P＜0．01，c表示P＜0．05。

组别 停灌前 再灌注后20min 40min CK／（U／L）正常组 13．7±6．25 9．10±4．71 8．20±5．02 I／R 组 13．6±4．96 49．3±20．43a57．5±15．54a LAE组 14．1±5．60 17．1±8．54b 23．7±11．43b LDH／（U／L）正常组 11．3±2．78 10．1±2．05 9．70±2．34 I／R 组 11．4±5．34 26．2±7．34a23．3±8．40a LAE 组 12．8±3．45 16．4±5．35b 18．4±7．56c

2．5 薰衣草花水煎液对缺血再灌注损伤大鼠离体心脏心肌组织SOD和MDA水平的影响

结果见表3。由表3可知：I／R损伤后，心肌组织中SOD活性明显降低（P＜0．01），MDA水平显著升高（P＜0．01），表明I／R可致心肌组织发生严重的氧化胁迫损伤。50mg／L LAE预处理后I／R损伤离体心脏心肌组织SOD活性明显高于I／R组（P＜0．01），而 MDA含量明显降低（P＜0．01），表明薰衣草花水煎液预处理可改善I／R所致心肌组织氧化胁迫状态，从而保护心肌组织。

表3 薰衣草花水煎液对缺血再灌注损伤大鼠离体心脏心肌组织SOD和MDA水平的影响，n＝8Tab．3Effects of lavandula decotion（LAE）on SOD activity and MDA level after ischemia／reperfusion（I／R）injury in isolated rat heart

表3 薰衣草花水煎液对缺血再灌注损伤大鼠离体心脏心肌组织SOD和MDA水平的影响，n＝8Tab．3Effects of lavandula decotion（LAE）on SOD activity and MDA level after ischemia／reperfusion（I／R）injury in isolated rat heart

注：与正常组比较，a 表示P＜0．01；与模型比较，b 表示P＜0．01。

组别 剂量／（mg／L）再灌注后SOD／（U／mg Prot） MDA／（μmol／kg Prot）9．81±0．41 188．2±25．02模型组 — 3．23±0．63a 457．5±30．54a LAE 组 50 7．01±0．45b 223．7±31．43正常组 —b

3 讨论

心功能的改变为心肌缺血再灌注损伤的主要表现之一，具体表现为再灌注损伤后血流的恢复与心功能恢复不一致，甚至恶化导致患者死亡。本次实验结果证明，缺血再灌注后LVDP降低，＋dp／dtmax和－dp／dtmin均下降，CF减少，HR减慢，结果与文献［7］报道一致，薰衣草花水煎液处理可增加再灌注后的CF，改善心脏功能，升高LVDP和±dt／dpmax，提高HR。I／R可造成细胞膜通透性升高，细胞内的某些酶可游离至细胞外，进入血液循环，如LDH和CK，可作为评价心肌损伤程度的标志物［8］。本实验表明薰衣草花水煎液可减少冠脉流出液中LDH和CK水平，并对I／R所致缺血心肌坏死有明显抑制作用，进一步表明薰衣草水煎液对I／R所致心肌细胞损伤有保护作用。

研究表明，心肌缺血再灌注过程可产生大量活性氧，可造成构成生物膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，以致细胞的膜功能遭到破坏［9］。MDA是生物膜脂质过氧化反应的代谢产物，其含量间接反映机体组织氧化应激状态。SOD可直接清除超氧阴离子，是维持机体氧化还原平衡状态的重要抗氧化酶之一，SOD和MDA是目前公认的能反映氧化应激反应程度的指标［10］。本研究结果显示，缺血再灌注后大鼠离体心肌组织SOD活性明显降低，MDA含量明显升高，表明心肌组织处于严重的氧化胁迫状态。薰衣草花水煎液预处理后缺血再灌注心肌组织SOD活性明显升高，而MDA水平降低，充分表明薰衣草花水煎液对缺血再灌注所致氧化胁迫损伤有保护作用。

总之，薰衣草花水煎液中含有心脏保护的活性成分，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究为传统维药薰衣草的临床应用提供了理论依据，对其活性成分的进一步追踪有望寻找到新的心脏保护药物。

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Protective Effects of Lavandula on Myocardial Ischemia
／Reperfusion Injury in Isolated Rat Heart

FU Wei1，YANG Caiyu1，LIU Ting1，LI Defang1，WANG Zhenhua1，ZHENG Qiusheng1，YUAN Chengshan2，WANG Chunming3
（1School of Pharmacy／Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Ministry of Education，Shihezi University，Shihezi 832002，China；2State Key Laborafory of Applied Organic Chemistry／College of Chemistry and Chenical Engineering；Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

To investigate the cardioprotective effects of lavandula on ischemia／reperfusion injury（I／R）in isolated rat heart，the myocardial I／R injury of rat isolated heart was prepared by Langendorff retrograde perfusion technology．The heart was pre－perfused with K－H solution containing lavandula decotion（LAE，50mg／L）for 10min before 20－minute global ischemia or 30－minute focal ischemia，then the reperfusion with K－H solution was conducted for 40min．The left ventricular developed pressure（LVDP），the maximum up／down rate of left ventricular pressure（±dp／dtmax）were recorded by physiological recorder as the myocardial function and the myocardial infarct size was detected by TTC staining．Lactate dehydrogenase（LDH）and CK activities in the effluent were measured to determine the myocardial injury degree．The su－peroxide anion dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）in myocardial tissue were detected to determine the oxidative stress degree．Results The pre－treatment with 50mg／L LAE significantly decreased the myocardial infarct size，while increased the LVDP，±dp／dtmaxand the coronary artery flow in isolated rat heart．The treatment of LAE also decreased the LDH and CK activities in the effluent and MDA in myocardial tissue．LAE treatment increased the SOD activities in myocardial tissue．Lavandula possesses the cardioprotective effect against the I／R injury and the antioxidative activity may mediate its efficacy．

Lavandula；decotion；ischemia／reperfusion injury；isolated heart

R966

A

2010－01－05

国家自然科学基金项目（30760058），新疆兵团医药卫生专项（2007GG23），新疆兵团博士资金项目（2008GC－12），新疆兵团基础研究计划（2007JC03）

付伟 （1983－），男，硕士生，专业方向为心血管药理学。

王振华（1973－），男，副教授，从事细胞和分子药理学研究；e－mail：zhenhuawang＠tom．com。