PRKAA2基因多态性与2型糖尿病患者血脂的关系

马 宁 张吉平 刘 静

（1.徐州医学院附属连云港医院内分泌科，江苏 连云港 222002；2.兰州大学临床医学院，甘肃 兰州 730030）

腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种重要的丝/苏氨酸蛋白激酶，在调解糖、脂肪、蛋白质代谢中发挥着重要作用。最近许多研究表明AMPK可能在2 型糖尿病的运动治疗中发挥了重要作用，故AMPK 对糖脂代谢的影响受到高度重视，相关研究也日趋深入。2型糖尿病患者普遍存在胰岛素抵抗，有证据表明AMPK通过影响脂代谢在改善胰岛素抵抗方面发挥重要作用[1]。因此，我们通过单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)研究方法分析AMPKα2亚单位编码基因PRKAA2与2型糖尿病患者血脂的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

按照世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1999年诊断标准随机选择104例糖尿病患者。

1.2 方法

①用酚/氯仿法抽取基因组DNA；②位点选择：使用SNPbrowser软件，按照pairwise r2算法选择PRKAA2基因标签SNP（Tagging SNP，tSNP）。设定R2=0.8，MAF=0.2，选择rs2796495位点进行检测；③PCR扩增：上游引物5′ctcacatcactgctaggaaacc3′，下游引物5′taggactcatacccaaacg3′。扩增采用降落PCR，即95℃预变性3 min，继之95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，每5个循环退火温度降低2℃直至53℃，共30个循环，最后72℃延伸7 min；④ 突变检测：扩增样本经2%琼脂糖凝胶电泳检测后用变性高效液相色谱仪检测突变。上样量为5 μL，退火温度经WAVE软件分析后确定为54.5℃。所有样本经第一次检测后随机抽取单峰样本和非单峰样本测序，确定其基因型（样本送上海生工进行测序）。将所有单峰样本与测序野生型样本等体积混合，经变性退火后进行第二次DHPLC检测，以区分野生型和纯和突变。

1.3 统计学分析

Hardy-Weinberg平衡定律检测基因型群体代表性。计数资料比较采用χ2检验。计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。不满足正态分布和方差齐性时采用非参数检验。采用SPSS 11.5进行统计分析，以P＜0.05（双侧）为有统计学意义。

经Hardy2Weinberg 遗传平衡定律检验χ2=0.0049，P=0.944，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性(表1)。

2 结果

2.1 基因频率分布

表1 rs2796495不同基因型者一般资料比较(±s)

表1 rs2796495不同基因型者一般资料比较(±s)

基因型 CC CT TT例数(n)（男/女）43(28/15) 48(32/16) 13(8/5)年龄(岁) 55±2 58±2 56±3体重指数(kg/m2)24.36±0.55 24.61±0.42 26.00±0.68空腹血糖(mmoL/L)11.47±0.96 12.44±0.95 13.96±2.28 2小时血糖(mmoL/L)17.41±1.12 18.69±1.47 18.74±3.07

2.2 不同基因型间血脂水平比较

总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）比较显示三组间不完全相同，P值分别为0.018、0.012。CC、CT、TT三组间总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇依次升高，其中CC与TT型比较差异有统计学意义，P值分别为0.047、0.028。但是经年龄、性别、体重指数校正后TC间的差异失去统计学意义（P=0.086），LDL-C间的差异仍有统计学意义（P=0.037）(表2)。

表2 rs2796495基因型间血脂水平比较(±s)

表2 rs2796495基因型间血脂水平比较(±s)

注：a：CC型与TT型比较P＜0.05，b：CT型与TT型比较P＜0.05，c：经自然对数转换后进行统计。

基因型 总胆固醇 甘油三脂c 高密度脂蛋白胆固醇c 低密度脂蛋白胆固醇(mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)CC 4.51±1.41a 2.11±0.98 0.93±0.29 1.95±0.76a CT 4.96±1.24 1.84±0.82 0.92±0.21 2.15±0.56 TT 5.51±0.90 2.38±1.92 1.07±0.25 2.55±0.95

3 讨论

AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是由α、β、ɣ三个亚基组成的异源三聚体蛋白，其中α亚基又包括α1、α2两个亚单位。不同的亚单位由不同的基因编码，其中α2亚单位的编码基因为PRKAA2。对AMPK基因敲除小鼠研究发现α2基因敲除小鼠出现胰岛素抵抗[1]。AMPK蛋白与血脂代谢有着密切关系。乙酰辅酶A 羧化酶(ACC)和羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶(HMGR)分别在脂肪酸和胆固醇的合成中起关键作用[2]。ACC是脂肪酸合成的限速酶，而HMGR为胆固醇合成的限速酶。ACC和HMGR 均是AMPK的靶分子。激活的AMPK可以使它们磷酸化，抑制它们的功能，从而抑制肝脂肪酸和胆固醇的合成[3]。此外AMPK还参与了甘油三酯的调节。在脂肪细胞中，AMPK激动剂不仅可通过ACC 磷酸化而抑制脂肪生成，还可通过磷酸化抑制激素敏感脂肪酶，从而抑制异丙肾上腺素所诱导的脂肪分解[4]。另外，AMPK能抑制肝细胞中重要的脂肪生成转录因子—固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1）的mRNA和蛋白质的表达[5]。AMPK这种既调节脂肪合成，又对抗脂肪分解的作用，可以减少血液中游离脂肪酸浓度，减少脂毒性。Horikoshi[6]等研究发现编码α2亚单位的基因PRKAA2多态性与日本人群胰岛素抵抗和2型糖尿病有关。Spencer-Jones[7]等对英国正常妇女PRKAA2基因的5个tSNP位点研究发现其多态性均与低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇变化有关。我们的研究提示编码AMPKα2亚基的PRKAA2基因的tSNP rs2796495多态性位点与胆固醇水平相关，有突变T等位基因的个体其胆固醇，尤其是低密度脂蛋白胆固醇更高。这与AMPK蛋白的功能相一致。基因的功能是通过其编码的蛋白质发挥的，因此考虑rs2796495的变异可能影响到了AMPK蛋白的表达活性。

综上所述，本研究结果显示PRKAA2基因标签SNP rs2796495与低密度脂蛋白胆固醇水平密切相关，其进一步的研究对预防糖尿病血管并发症的发生有一定临床意义。需强调的是，该多态性位点虽然是一个标签SNP位点，但其位于基因的内含子，因此，这一多态性是否会直接引起基因的功能或表达改变，或者仅仅是与真正的致病性多态性位点呈连锁不平衡的一个多态性标志，还有待于进一步的研究证实。

[1]Villena JA,Viollet B,Andreelli F,et al.Induced adiposity and adipocyte hypertrophy in mice lacking the AMP-activated protein kinasealpha2 subunit[J].Diabetes,2004,53(9):2 242-2 249.

[2]Kemp BE,Stapleton D,Campbell DJ,et al.AMP-activated protein kinase,super metabolic regulator[J].Biochemical Society transactions,2003,31(1):162-168.

[3]Henin N,Vincent MF,Gruber HE,et al.Inhibition of fatty acid and cholesterol synthesis by stimulation of AMP-activated protein kinase[J].FASEB J,1995,9(7):541-546.

[4]Sullivan JE,Brocklehurst KJ,Marley AE,et al.Inhibition of lipolysis and lipogenesis in isolated rat adipocytes with AICAR,a cellpermeable activator of AMP-activated protein kinase[J].FEBS Lett,1994,353(1):33-36.

[5]Zhou G,Myers R,Li Y,et al.Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action[J]. J Clin Invest,2001,108(8):1 105-1 107.

[6]Horikoshi M,Hara K,Ohashi J,et al.A polymorphism in the AMPKalpha2 subunit gene is associated with insulin resistance and type 2 diabetes in the Japanese population[J].Diabetes,2006,55(4):919-923.

[7]Spencer-Jones NJ,Ge D,Snieder H,et al.AMP-kinase alpha2 subunit gene PRKAA2 variants are associated with total cholesterol,low-density lipoproteincholesterol and high-density lipoprotein-cholesterol in normal women[J].Journal of medical genetics,2006,43(12):936-942.