129/J小鼠超排效果的研究

关文怡 曹授俊 齐军喆 （北京农业职业学院畜牧兽医系 102442）

用激素处理动物进行超数排卵是进行胚胎移植、转基因、克隆等研究的基础之一，通过超数排卵获得大量整齐、优质的卵子或受精卵是胚胎移植的关键技术之一。近年来，随着遗传工程小鼠的大量开发，人们对小鼠卵母细胞和受精卵的需求量日趋增多，因而完善的超数排卵技术是遗传工程小鼠研究获得成功的重要前提条件。本试验在雌鼠的年龄与体重、激素的注射时间等因素不变的条件下，以129/J小鼠为试验材料，对注射不同剂量的PMSG和HCG对小鼠进行超数排卵试验，并分析获得卵母细胞的数量和质量。

1 材料和方法

1.1 试验动物 5～6周龄129/J雌性小鼠30只和8周龄129/J雄性小鼠(中国医学科学院试验动物研究所)。

1.2 试验器械 实体显微镜Nikon SM2645(日本Nikon公司)；手术器械：剪毛剪、手术剪、镊子等；口吸式移卵管。

1.3 试验试剂 试验超数排卵激素(PMSG，HCG)均购自宁波市激素制品有限公司；其余试剂除特殊说明外均为Sigma(Sigma Chemical, St.Louis, MO, USA)公司产品。

1.4 试验方法 选用5～6周龄的129/J雌鼠30只，自由采食和饮水，室温20±2℃，控光(光照14h/d，6:00～20:00)。经过1周的适应性饲养后，按照注射剂量不同分别分为A组(PMSG 2.5IU，HCG 2.5IU)、B组(PMSG 5.0IU，HCG 5.0 IU)、C组(PMSG 7.5IU，HCG 7.5IU)，每组10只。每只小鼠腹腔注射PMSG，间隔48h后分别注射HCG进行超数排卵，再与性成熟同系公鼠合笼，次日早上检查阴道栓，有栓雌鼠以颈椎脱臼法处死。将输卵管摘除置于盛有M2培养液的表面皿中，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用1m1注射器冲洗输卵管，再用移卵管收集卵母细胞。超数排卵处理后，对不同处理组的雌鼠进行卵母细胞计数。

1.5 统计分析 利用SPSS对129/J小鼠不同剂量组的平均取卵数采用单因素方差分析进行检验。

2 结果

本试验分为A、B、C3个剂量组，获得卵子数量如表1所示。129/J小鼠C组的平均取卵数极其显著的高于A组和B组的平均取卵数；B组与A组的平均取卵数差异不显著。

表1 129/J小鼠超数排卵试验结果

3 分析与讨论

哺乳动物发情周期中给予大量外源FSH 或类似物，可诱发大量卵母细胞发育，排卵数可超过正常排卵数的若干倍[1]。在小鼠的超排试验中，一般用孕马血清促性腺激素PMSG模仿内源性促卵泡素FSH的促进卵成熟作用，人绒毛膜促性腺激素HCG模仿促黄体素LH的诱导作用。超数排卵有成功与否取决于雌鼠的年龄与体重、激素的剂量和注射时间以及小鼠的品系。

关于小鼠超数排卵的最适合的激素剂量，目前国外多采用PMSG与HCG各5IU[2]或各7.5IU[3]剂量，国内有的采用PMSG与HCG各5IU[4]或各10IU[5]剂量的方法，也有采用PMSG与LH超排小鼠的报道[6]。由此可知，激素剂量方面的研究结果还有一定的差异。这可能与超数排卵受到多种因素的影响有关。对于大多数品系小鼠推荐的PMSG剂量是腹腔注射5IU，但对有些品系小鼠2.5IU或多达10IU效果可能更好。李子义等[7]在不同激素剂量对幼鼠超数排卵及超排卵质量的影响中报道以PMSG与HCG各10IU剂量对5～6周龄小鼠进行超排，结果排卵数分别是42.2枚和40.2枚。另一种促性腺激素是HCG用来诱发成熟卵泡破裂，HCG的一般注射剂量为5IU，但对某些品系小鼠来说，适合的剂量可能在2.5IU～10IU之间。本试验选用5～6周龄的129/J雌鼠，采用激素3种不同剂量组合在自由采食和饮水，室温20±2℃，控光(光照14h/d，6:00～20:00)的条件下采用PMSG 7.5IU，HCG 7.5IU剂量组合排卵数显著高于其它组，为较好的超数排卵方案。

小鼠超数排卵效果除与激素剂量不同有关外，可能与试验小鼠个体的日龄、发情周期、体重及营养状况有关。

[1]王建辰. 家育生殖内分泌学[M]. 北京:农业出版社,1991. 64.

[2] Kodayashi K,Okuyama M, Fujimoto G,et al . Subzonal insemi2nationwith asingle spematozoon using manipulation assisted sperm adhesion onto theooplasmic membrance in mouse ova [J]. Mol. Rprod Dev, 1992,31: 223～229.

[3]Kimura Y, Yanagimachi R. Mouse oocytes In jected with testl2 cularspermatozoa or round spermatids can develop into normal off spring[J]. Development ,I995 ,121 :2397～2405.

[4]李秦,朱德生,刘玉林,等. 不同激素对哺乳动物超数排卵作用的研究[J]. 实验动物科学与管理, 1997, 14 (3):126.

[5]刘红林,范必勤,陈宜峰等. 小鼠卵母细胞的乙醇激活[J]. 南京农业大学学报, 1996 ,19 (4) :56-60.

[6]钱菊汾. PMSG配合L H 促使小鼠超数排卵效果分析[J]. 北京农学院学报, 2000 ,15 (1) :25-28.

[7]李子义,谭景和,孙兴参等. 不同激素剂量对幼鼠超数排卵及超排卵质量的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医, 1999, (3): 224.