甘草黄酮提取及其抗氧化能力测定方法研究进展

韩雅慧，陶宁萍

（上海海洋大学食品学院，上海201306）

甘草又名甜草、蜜草、美草等，其药用部位为豆科（Leguminosae）植物甘草属（Glycyrrhiza）甘草（Licorice）的根及根状茎[1]。据《中华人民共和国药典》2000年版记载，甘草有3个品种，即乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensi Fisch）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L）[2]。甘草有效成分包括黄酮类、三萜类、多糖等。迄今为止，已从甘草中分离出150多个黄酮类化合物，主要包括黄酮类、黄酮醇类、查尔酮类、双氢黄酮类、双氢查尔酮类等[3]。甘草黄酮具有明显的抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保肝等药理作用，尤其在发现它具有抗艾滋病病毒[4]作用后，甘草黄酮类化合物的研究引起了人们的广泛关注和重视。

本文综述了甘草黄酮的提取方法及其抗氧化能力测定方法的研究现状，以期为甘草黄酮类成分的进一步开发利用提供参考。

1 甘草黄酮的提取方法及比较

1.1 甘草黄酮的提取方法

甘草黄酮的提取方法很多，基本原理都是通过物理、化学方法破坏甘草的细胞壁，再根据甘草黄酮的极性及溶解性能的差异进行提取分离。1.1.1 溶剂萃取法 它包括无机溶剂萃取法和有机溶剂萃取法。其主要原理是利用甘草黄酮能溶于碱水或甲醇等有机溶剂的特性来提取甘草黄酮。其中，有机溶剂萃取法是目前国内外提取甘草中黄酮类物质最为广泛的方法，可用冷浸法或加热抽提法提取，乙醇和甲醇是普遍采用的浸提液。但建明等[5]以NaOH水溶液为浸提液，正交设计提取甘草渣中黄酮类化合物得出，最佳提取工艺为0.2 mol/LNaOH，料液比为1∶14，提取温度90℃，提取时间0.5 h。刘晓风等[6]利用乙醇回流法提取市售甘草黄酮，正交试验得到最佳提取工艺为料液比1∶20，提取温度85℃，提取时间3 h，乙醇浓度75%，提取率达到2.49%。杨慧等[7]选择NaOH和乙醇的混合溶液作为浸提液，利用回流法提取内蒙古产甘草渣中黄酮，试验获得的最佳工艺条件为碱醇（NaOH浓度0.4 mol/L，乙醇浓度75%）比为1∶2，料液比1∶30，回流时间3 h，回流温度95℃，提取率达到4.21%。田庆来等[8]以三烷基氧化膦（Trialkylphosphine Oxide，TRPO）石油醚溶液为浸提液，对市售甘草片进行黄酮提取，正交试验表明，TRPO浓度影响总黄酮提取率程度大于有机相与水相的体积比（A/O），总黄酮提取率随A/O的增大而减小，随浸提液浓度的增大迅速提高，通过此法可实现水溶性甘草黄酮和甘草酸的分离。

1.1.2 超声辅助溶剂提取法 其原理是利用超声波使植物组织在溶剂中瞬时产生空化泡崩溃，进而细胞破裂，溶剂与植物细胞内部成分相互渗透，增加了黄酮在溶剂中的溶解。曾超珍等[9]利用此法通过正交试验提取市售甘草中的黄酮得出，在超声功率385 W，80%乙醇，料液比1∶15，提取时间8 min的提取条件下，黄酮提取率达到6.23%。刘红等[10]研究了超声时间对人工栽培2年生乌拉尔甘草中黄酮提取率的影响，结果表明，在室温下超声提取80 min较合适。另外，王应强[11]、何璐[12]、李炳奇[13]等分别对不同甘草品种进行超声辅助提取的工艺研究，表明超声技术已广泛应用于甘草黄酮的提取。

1.1.3 微波辅助溶剂提取法 微波可直接作用于分子，使其热运动加剧，温度升高，这种热效应使微波穿透到介质内部，加速细胞壁的破坏，使甘草黄酮类物质更快地被分离提取出来。孙萍等[14]首次使用微波法从甘草中提取黄酮，测得黄酮提取率为1.721%。张明华等[15]采用微波辅助乙醇提取法对乌拉尔甘草进行黄酮提取的条件优化，单因素试验结果确定最佳工艺条件为：料液比为1∶18，预浸泡时间1 h，微波功率420 W，乙醇浓度70%，微波时间50 s，微波次数1次，黄酮提取率为4.080 7%。史高峰等[16]设计正交试验，采用微波辅助法对甘草渣（宁夏产，1年生）中总黄酮提取方法进行研究，结果显示，在80%乙醇，料液比1∶10，微波功率300 W，微波辅助回流60 min的条件下，黄酮提取率为0.408%。张梦军等[17]采用均匀设计来优化微波提取市售甘草中黄酮的试验条件，并且将微波法与水浸提法进行了比较，微波法优化结果为：料液比1∶8，乙醇浓度38%，微波功率288 W，加热时间1 min，通过试验发现微波法的提取效率明显优于水浸提法。

1.1.4 超临界流体萃取法（SFE） 在超临界状态下，超临界流体与待分离的物质接触，有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取出来，并且通过控制CO2的压力和温度来控制溶解度和蒸汽压这2个参数来进行分离。超临界萃取通过使植物细胞壁高度破碎，增加黄酮类物质与溶剂的接触面积和萃取通道，同时还使黄酮与纤维素结合力降低，从而提高萃取率。付玉杰等[18]以萃取温度、萃取压力、夹带剂用量、CO2流量、分离压力和分离温度为指标，确定超临界CO2萃取乌拉尔甘草中黄酮的最佳工艺条件，并以此最佳工艺与乙醇提取法进行比较，结果表明，超临界CO2萃取法的甘草黄酮提取率比溶剂提取法高2.2倍。付玉杰等[19]还采用单因素试验对甘草地上部分（茎叶）的超临界CO2提取工艺进行了研究，以总黄酮提取率和含量为指标，总黄酮提取率达到2.09%，黄酮含量为5.42%，为工业化SFE-CO2法生产粗甘草黄酮提供了有价值的工艺参数。

1.1.5 复合酶法 它是在传统的溶剂提取方法的基础上，根据植物药材细胞壁的构成，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择相应的酶，将细胞壁水解或降解，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的目的。张志东等[20]利用复合酶法结合醇提法提取甘草废渣中的黄酮，确定了复合酶处理的条件，即：纤维素酶添加量833.5 nkat/mL，果胶酶1 667 nkat/mL，反应pH 6.0，温度55℃，作用120 min，最终提取率达到2.25%，该法较利用醇提法提取甘草渣中黄酮得率提高了25%以上。王芸芸等[21]采用纤维素酶和果胶酶从甘草渣中提取甘草总黄酮，并与醇提法相比较，结果得出，复合酶法提取的游离总黄酮含量提高了1.15倍。

1.1.6 闪式提取法 其主要原理是在适当溶剂存在条件下，利用高速机械剪切力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使细胞组织内部的有效成分与溶剂充分接触，快速溶解转移，在短时间内达到内外溶解平衡。邓引梅等[22]对比研究了闪式提取、索氏抽提、搅拌提取、超声波提取对胀果甘草叶总黄酮的提取效果，并利用正交试验对提取工艺进行了优化，结果表明，用闪式提取法提取时间短，提取溶剂用量少，最佳提取工艺为：料液比1∶40，乙醇浓度70%，提取时间6 min，黄酮提取率为2.917%。此后，邓引梅等[23]又在单因素试验基础上探索了响应面法确定闪式提取甘草叶中总黄酮的最优提取工艺参数的可行性，最佳工艺条件为：料液比1∶40.3，乙醇浓度70.2%，提取时间5 min，在此工艺条件下，总黄酮的提取率达到2.91%，与模型预测值基本相符。

1.1.7 半仿生提取法（Semi-bionic Extraction method，SBE法） 其原理是从生物药剂学的角度，模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理，为经消化道给药的中药制剂创立一种新的提取工艺。孙秀梅等[24]对甘草饮片颗粒化研究，SBE提取工艺将水浸提提取工艺中pH 7.0的水分别改用pH 2.0的水作第1煎，pH 6.5的水作第2煎，pH 9.0的水作第3煎，制得SBE液，并以甘草次酸、甘草总黄酮、浸膏量为指标，将2种方法进行比较，研究表明，SBE法优于水浸提法。徐萍[25]将方药分成混煎组和桂枝、甘草单煎混合组，用半仿生提取法提取，提取液作甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油、干浸膏的含量测定及50%乙醇精制液的HPLC指纹图谱比较，结果表明，除干浸膏含量单煎混合液与混煎液相近外，其余4个指标成分的含量，混煎液均明显高于单煎混合液。

1.2 7种提取方法的优缺点比较[26]

上述方法各有优缺点（表1），在提取甘草黄酮时，多采用2种或2种以上的方法辅助提取，如超声-微波协同萃取法[27]、复合酶法及微波法[28]等。汪河滨等[29]比较了溶剂提取法、超声波、微波、超声-微波协同萃取4种不同提取方法提取甘草黄酮的效果，结果表明，超声-微波协同萃取法提取甘草黄酮效果最好。

表1 7种提取方法的优缺点比较

2 甘草黄酮的抗氧化能力测定方法[30-31]

国内外对抗氧化剂的研究十分重视，近几年，美国、日本及欧洲国家均将其作为功能食品素材的研究重点，并已建立了多种测定甘草黄酮抗氧化活性的方法。现将常用的方法分述如下。

2.1 国标法

参照国家标准GB/T 5009.37—1996中食用油过氧化值（POV）的检验方法进行测定。崔永明等[32]使用此法测定了甘草总黄酮对4种油脂的抗氧化作用，结果显示，甘草黄酮可以作为油脂的抗氧化剂，并且其对猪油的抗氧化效果更好。朱少华等[33]对甘草查尔酮抗脂质过氧化及清除自由基的能力进行研究，发现甘草查尔酮具有明显的抗脂质过氧化作用，其作用机制可能是对羟基自由基（·OH）的直接清除作用所致。

2.2 FRAP法[34]

FRAP（铁离子还原能力，ferric ion reducing antioxidant power）法又称氧化还原法，其原理是甘草黄酮中的抗氧化物质将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与Fenton类物质形成稳定的络合物，反应的结果以Fe2+的当量或标准物质的抗氧化能力表示。该法具有快速简便，易于操作，重复性好等优点。李铭花等[35]研究甘草4种不同极性溶剂提取物中黄酮和总酚含量，并采用FRAP法测定各提取物的抗氧化能力，结果显示，极性较大的有机溶剂的对应提取物还原能力较强，且甘草总酚、黄酮含量与其抗氧化活性间存在较好线性关系。吴碧华等[36]研究了甘草黄酮对Fenton反应生成的·OH具有较强的直接清除作用，其清除·OH的IC50（自由基被抑制1/2时抑制剂的浓度）是甘露醇的1/255，其抑制·OH生成的IC50是甘露醇的1/139，提示了甘草总黄酮有可能作为一种新的天然抗氧化剂。此后，吴碧华等[37]又研究了甘草黄酮对超氧阴离子（O2-）和·OH的清除和抑制作用，结果表明，甘草黄酮不仅对·OH具有清除作用，且清除率与药物浓度呈正相关，而且对·OH的生成速度也具有明显的抑制作用，疗效明显优于维生素E和甘露醇。

2.3 DPPH法[38]

DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼）是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，抗氧化物质可以使其还原、颜色变浅，根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。赵丽娜等[39]对新疆产3种甘草渣中甘草黄酮含量及其抗氧化活性进行了比较研究，结果显示，3种甘草渣中总黄酮含量以乌拉尔甘草渣最高，其DPPH清除率达到4.08%。罗峰等[40]研究了光果甘草、乌拉尔甘草、胀果甘草3种甘草品种的总黄酮提取方法，DPPH法测定其抗氧化活性，并分析了甘草品种、应用微波处理、甘草放置时间、提取温度对甘草抗氧化活性的影响，结果显示，除提取温度外，其他3个因素对甘草抗氧化活性有较大影响。

2.4 邻苯三酚自氧化法[41]

在碱性条件下，邻苯三酚能迅速自氧化，释放出O2-·，生成带色的中间产物，且邻苯三酚自氧化速率与生成O2-·的浓度呈正相关，中间产物在420 nm波长有强烈光吸收。抗氧化剂能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，故可通过紫外可见光分光光度法来定量测定抗氧化剂在此体系中对O2-·的清除作用，间接评价抗氧化剂的抗氧化能力。索金玲等[42]采用此法评价了石榴叶总黄酮提取物的体外抗氧化能力，结果表明，石榴叶总黄酮抑制邻苯三酚自氧化能力高于维生素C。杨玲等[43]利用超声-微波系统萃取乌拉尔甘草中多糖类物质，并利用DPPH法、FARP法及邻苯三酚自氧化法分别测定甘草多糖对DPPH·，·OH和O2-·的清除能力，结果表明，在同等浓度下，甘草多糖对DPPH·清除能力强于维生素E但低于维生素C，清除·OH能力比O2-·强。

2.5 荧光分光光度法[44]

荧光法主要检测对羟基的抗氧化能力（Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity，HORAC），其原理是过氧化氢自由基对荧光探针具有氧化作用，并使得探针的荧光减弱，当有抗氧化剂存在时，探针的荧光减弱被抑制。根据这一特性，可测定样品对氧自由基清除活性，测定结果以TroloxTM（标准抗氧化剂）当量表示，具体在衰变曲线中，常使用AUC（曲线下面积）作为最终指标。WANG[45]主要研究了L-苯氨酸-Fe2+-H2O2体系产生羟基自由基的最佳条件，并测试了赤芍、钩藤、姜黄、炒蒺藜4种黄酮类中草药水提物的抗氧化活性，建立了一种测定中草药抗氧化活性的方法。李满秀等[46]研究了山楂、槐米、沙棘茎皮3种样品提取物对O2-·的清除作用，结果显示，3种样品对O2-·的清除能力与提取物浓度均有明显的量效关系，且它们清除O2-·的能力依次为：槐米＞沙棘＞山楂。

3 前景与展望

目前，市场上已经有很多的黄酮产品，比如黄酮片、六味黄酮茶以及各种黄酮类药品。甘草黄酮虽然具有明显的抗氧化作用，可以预防肿瘤的发生，对胃溃疡、肝损害、病原微生物、酶及抗炎和抗变态反应等方面都有明显的药理作用，但甘草黄酮类的产品却很少，所以使用先进的分析分离技术，特别是对甘草黄酮类化合物中单一成分分离纯化，可为新药、新产品资源的开发提供一定的理论依据。

［1］ 季字彬，姜薇，范玉玲，等.甘草黄酮的研究进展[J].中草药，2004，35（9）：52-61.

［2］ 丛景香，高丽娟，林炳昌，等.甘草黄酮类化合物研究进展[J].精细化工，2004，10（21）：21.

［3］ 邢国秀，李楠.甘草黄酮类化学成分的研究进展[J].中国中药杂志，2003，28（7）：593-597.

［4］ 李明，张清云，蒋齐，等.氮磷钾互作效应对甘草黄酮含量影响的初步研究[J].土壤通报，2007，38（2）：301-303.

［5］ 但建明，李文娟，洪成林，等.甘草渣中黄酮类化合物的提取工艺研究 [J].石河子大学学报（自然科学版），2004，22（5）：427-428.

［6］ 刘晓风，相炎红，张百刚，等.甘草黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2009，37（6）：2542-2543.

［7］ 杨慧，蒋柏泉，白兰莉.溶剂回流萃取甘草渣黄酮[J].江西化工，2006（3）：90-92.

［8］ 田庆来，谢渝春，张波，等.溶剂萃取法分离水溶性甘草黄酮[J].过程工程学报，2007，7（3）：496-500.

［9］ 曾超珍，刘志祥，吴耀辉，等.超声波提取甘草黄酮及其抑菌活性研究[J].时珍国医国药，2007，18（10）：2402-2403.

［10］ 刘红，李炳奇，汪河滨，等.超声时间对甘草黄酮提取率影响的研究[J].黑龙江中医药，2005（1）：52-54.

［11］ 王应强，张静，段玉峰.超声波提取甘草黄酮的工艺研究[J].粮油食品科技，2006，14（3）：42-43.

［12］ 何璐，王勇，吕跃东，等.甘草黄酮的提取分离及抗菌活性研究[J].湖北农业科学，2008，47（2）：217-219.

［13］ 李炳奇，汪河滨，李学禹，等.超声法联合提取甘草黄酮和甘草酸的研究[J].山东中医杂志，2005，24（1）：38-40.

［14］ 孙萍，李艳，成玉怀.甘草总黄酮的微波提取及含量测定[J].时珍国医国药，2003，14（5）：266-267.

［15］ 张明华，蒋柏泉，白兰莉.微波辅助乙醇浸提甘草废渣黄酮的研究[J].江西化工，2006（3）：111-113.

［16］ 史高峰，韩学哲，陈学福，等.微波辅助提取甘草渣中的总黄酮工艺研究[J].安徽农业科学，2008，36（32）：14153-14154，14184.

［17］ 张梦军，金建锋，李伯玉，等.微波辅助提取甘草黄酮的研究[J].中成药，2002，24（5）：334-336.

［18］ 付玉杰，祖元剐，赵春建，等.超临界二氧化碳萃取甘草黄酮的工艺[J].应用化学，2003，20（12）：217-219.

［19］ 付玉杰，施晓光，刘晓娜，等.超临界CO2提取甘草地上部分总黄酮[J].植物研究，2007，27（3）：372-375.

［20］ 张志东，王玮，楚敏，等.复合酶法提取甘草渣中黄酮类物质的研究[J].新疆农业科学，2008，45（4）：729-732.

［21］ 王芸芸，李莉，李香玉，等.复合酶法提取甘草渣中总黄酮[J].化学与生物工程，2008，25（8）：49-51.

［22］ 邓引梅，宋发军，崔永明，等.甘草叶总黄酮提取工艺[J].中南民族大学学报（自然科学版），2008，27（1）：41-43.

［23］ 邓引梅，崔永明，李唯，等.响应面法优化闪式提取甘草叶总黄酮工艺研究[J].化学与生物工程，2008，25（9）：44-47.

［24］ 孙秀梅，黄树明，王英姿.甘草SBE法与WE法的成分比较[J].中国中药杂志，1999，24（9）：542.

［25］ 徐萍.桂枝甘草汤方药半仿生提取醇沉法最佳醇沉浓度的优选[J].中国中医药信息杂志，2009，16（5）：56-58.

［26］ 魏炜，银建中，牛彻，等.甘草酸及甘草黄酮类物质的提取、精制和应用的研究进展 [J].化学工业与工程技术，2005，26（1）：30-33.

［27］ 毛宝兴，张连富.超声-微波协同萃取法提取甘草总黄酮工艺研究[J].天然产物研究与开发，2009，21（5）：150-154.

［28］ 高保英，张晓昱，余洪波，等.复合酶法及微波法提取甘草黄酮的比较研究[J].湖北中医杂志，2004，26（6）：52-53.

［29］ 汪河滨，周忠波，罗锋，等.甘草黄酮提取方法及抗氧化活性研究[J].时珍国医国药，2008，19（9）：2106-2107.

［30］ 韩飞，周孟良，钱健亚，等.抗氧化剂抗氧化活性测定方法及其评价[J].粮油食品科技，2007，17（6）：54-57.

［31］ 徐清萍，钟桂芳，孟君，等.抗氧化剂抗氧化方法研究进展[J].食品工程，2007（2）：23-25.

［32］ 崔永明，余龙江，敖明章，等.甘草总黄酮对油脂抗氧化作用研究[J].食品科学，2007，28（11）：119-121.

［33］ 朱少华，王大进，张玲莉，等.甘草查尔酮抗脂质过氧化及自由基的实验研究 [J].同济医科大学学报，1996，25（1）：25-27.

［34］ Benzie I F，Strain J J.The ferric reducing ability of plasma（FRAP）as a measure of“antioxidant power”：the FRAP assay[J].Anal Biochem，1996，239（1）：70-76.

［35］ 李铭花，杨文建，赵政，等.甘草不同极性溶剂提取物抗氧化活性研究[J].粮食与油脂，2009（3）：25-27.

［36］ 吴碧华，龙存国，王晓明，等.甘草总黄酮清除羟自由基作用的体外实验探讨[J].川北医学院学报，2001，16（1）：3-5.

［37］ 吴碧华，杨得本，龙存国，等.甘草总黄酮的体外抗氧化作用[J].中国临床康复，2004，36（8）：8262-8263.

［38］ Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].Lebensm Wiss Technol，1995，28（1）：25-30.

［39］ 赵丽娜，王银香，罗锋，等.三种甘草渣甘草黄酮含量及其抗氧化活性比较研究 [J].塔里木大学学报，2007，19（4）：14-16.

［40］ 罗锋，王咏梅，舒尊哲，等.甘草黄酮的提取及影响活性因素研究 [J].四川师范大学学报（自然科学版），2006，29（5）：613-615.

［41］ 韩少华，朱靖博，王妍妍，等.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J].中国酿造，2009（6）：155-157.

［42］ 索金玲，彭秧，张纵圆，等.石榴叶总黄酮提取工艺及体外抗氧化性研究[J].生物技术，2009，19（1）：63-65.

［43］ 杨玲，汪河滨，罗锋，等.甘草多糖清除自由基活性的研究[J].塔里木大学学报，2007，19（3）：1-3.

［44］ Cao G，Alessio H M，Cutler R G.Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants[J].Free Radical Biol Med，1993，14（3）：303-311.

［45］ WANG C P.Determination of Hydroxyl Radical and Antioxidant Activity of Chinese Herbs by Fluorospectroscopy[J].Journal ofDezhou University，2007，23（4）：40-42.

［46］ 李满秀，崔晓霞.荧光法测定黄酮类物质对超氧阴离子自由基的清除作用 [J].食品研究与开发，2007，28（2）：123-126.