冷冻电镜单颗粒重构中高分辨率病毒的三维显示

李 晶 李鲲鹏 柳 正 赵海燕

1(昆明总医院医学工程科，昆明 650032)

2(中山大学生命科学学院，广州 510275)

3(云南省第一人民医院眼科，昆明 650032)

冷冻电镜单颗粒重构中高分辨率病毒的三维显示

李 晶1*李鲲鹏2柳 正2赵海燕3

1(昆明总医院医学工程科，昆明 650032)

2(中山大学生命科学学院，广州 510275)

3(云南省第一人民医院眼科，昆明 650032)

利用冷冻电镜显微技术和单颗粒三维重建方法获得分辨率为1.3 nm的BmCPV(家蚕质多角体)，1.3 nm的BmCPV+mab(家蚕质多角体与抗体复合物)，2.5 nm的CSBV中蜂囊装幼虫病病毒，1.4 nm的 C6/36浓核病毒(C6/36DNV)组成的三维结构体数据。对三维结构数据进行数据归并，并找到对显示细节较为敏感的向量维度，用三维可视化技术对病毒做出快速高效显示。与原有显示方法相比，时间和信噪比有了显著提高，病毒表面细节和轴上突起更加清晰可见。为高分辨病毒三维重构开辟了新的可视方法。

冷冻电子显微技术;三维重构;三维显示;病毒

引言

病毒给予人类极大的危害，防治病毒是人类的重要任务。根据病毒结构上20面体对称的特性，计算机三维重构与冷冻电镜技术相结合产生冷冻电镜单颗粒技术(CryoEM)，成为研究病毒结构功能的主要手段［1］。应用此技术对病毒研究，最早是Crowther提出的［2］。该技术利用20面体的对称性和中央截面定理，确定电子显微图像中病毒颗粒的空间取向和中心位置，然后把大量的、确定了取向和中心位置的病毒颗粒空间叠加，重构出病毒的三维结构。至今，已经用此技术得到了大量病毒的三维结构［3］。用 Fourier-Bessel 合成法［4］进行三维重构，所得到的体数据中包含了噪声、空间叠加的位置误差，以及傅里叶变换等重构过程中的不良影响，导致在病毒的三维显示中出现伪结构［5］。为了消除这些影响，近年来出现了大量的病毒三维显示的研究［6］。比较成熟已经开始在国内外实验室中大量使用的软件有IRIS explorer，但它存在显示速度慢、显示参数较多、参数设定复杂、域值对噪声的敏感度较低等缺陷。为此，本研究应用可视化技术，首先对体数据进行归并，继而分析了显示平滑度和显示细节之间的关系，建立了新的显示域值体系。对高分辨率的重建数据 BmCPV(家蚕质多角体)、BmCPV+mab(家蚕质多角体与抗体复合物)、CSBV中蜂囊装幼虫病病毒、C6/36DNV(C6/36浓核病毒)进行了三维显示，得到了满意的结果，并验证了方法的快速高效。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验室多年来进行冷冻电镜病毒单颗粒技术的三维重构研究，现已经得到多种较高分辨率的病毒三维重构体数据。其中，包括有分辨率为1.3 nm的 BmCPV(家蚕质多角体病毒)与1.3 nm的BmCPV+mab(家蚕质多角体与抗体复合物［7］;2.5 nm的CSBV中蜂囊装幼虫病病毒［8］;1.4 nm的C6/36浓核病毒(C6/36DNV)的三维结构体数据［9］。以上述4种病毒高分辨三维重构的体数据作为依据进行三维显示研究。

1.2 方法

体数据的三维显示是将三维数据投影到二维图像显示器平面上，并利用计算机图形学的原理和技术，通过使用光照、透视及旋转等方法，获得三维视觉效果。目前的三维显示技术基本上可以分为面绘制和体绘制两大类。表面绘制的一般步骤是:首先在二维序列图像上提取对象的轮廓线，然后利用三角形面片来近似相邻的轮廓线之间的等值面，从而得到要显示对象的完整表面，最后采用传统的图形学方法加以显示。当体数据的采样密度足够大时，可以采用MC(marching cube)方法在表面体素内部提取等值面，得到高质量的表面显示结果。表面绘制的优点是可以清晰显示对象的表面情况，配合通用的显卡加速，具有较好的实时交互性。体绘制技术出现的时间较晚，是近几年三维显示技术研究的一个热点。它可以完整地反映数据域中所包含的整体信息，不需要构造中间几何图形元素，直接使三维空间数据场的采样可视化，单独或同时显示浓淡变化的表面和灰度实体。

体数据的空间位置由体数据的空间坐标决定，明暗属性由每个像素点的方向矢量决定。方向矢量的计算是:给出了x方向上的分量，y、z方向的分量有同样的形式，即

其中，N的大小决定了显示表面的平滑度。随着N增大，平滑程度逐渐提高，而细节却逐渐消失。实验证实，当N=3时，兼顾了平滑效果和显示细节，使显示达到最佳效果。设体数据空间像素为M(x，y，z)，其均值 avg，则方差为

做如下数据归并:当 M(x，y，z)≥avg+4msq时，取 M(x，y，z)=255;当 M(x，y，z)≤avg+4msq时，取 M(x，y，z)=0，其他为 M(x，y，z) ∈ (0，255)。

2 结果

基于以上方法研制开发了针对单颗粒技术病毒重构体数据的三维显示方法，并在 PC机上的Visual C++8.0开发环境下，附带有 OPGL接口，自主开发了应用软件Cryo-Electron Microscopy 3-Dimension Display System (CEM3DDS)。将CEM3DDS与IRIS explorer在显示速度和信噪比方面进行了比较得出以下结果。图1为IRIS和CEM3DDS两种软件对相同体数据bmCPV在不同阈值下显示耗时的比较。两个软件有在相同硬件条件的PC机上(CPU为AMD 3000，FireGL T2-128)运行，由图1可见，相同的体数据在各个阈值下，对较小的阈值，显示速度接近，在 A点(阈值100)以后，CEM3DDS的显示速度明显快于 IRIS。图2为IRIS和CEM3DDS在不同阈值下信号与噪声的幅度比较。实验分别测试了两个软件在不同阈值下所显示图像的信号以及噪声的幅度。由图2可见:在阈值的整个取值范围内，CEM3DDS的信噪比大于IRIS的信噪比;说明阈值在 CEM3DDS对噪声更加敏感，有利于显示质量的提高。图3是CEM3DDS对BmCPV与C6/36DNV的三维显示;(a)和(b)为不同方位的BmCPV三维显示图像，病毒的细节清晰可见;(c)和 (d)为 C6/36DNV的三维显示，是从5次轴两个不同方向观察的结果。5次轴的定点突出，清晰可见。图4为半个 BmCPV+mab矢状面、冠状面和横断面3个中垂直面的显示，CEM3DDS不但能够对病毒进行三维外部结构的显示，还能对病毒内部的任意剖面进行显示，可见BmCPV+mab病毒的内部结构清晰完整。图 5是半个 CSBV、BmCPV+mab的三维显示，从不同方位的CSBV三维显示图像可见，外部细节分明，内部结构清晰。同样，BmCPV+mab的三维显示可见，BmCPV与 mab结合位点结构清晰。由图3与图5的比较，可见BmCPV与 BmCPV+mab在结构上的不同，在BmCPV+mab突起的顶点多出了一个结构，称为ASpike，这个部分的结构与病毒功能有着密切的关系［10］。

图1 IRIS和CEM3DDS在不同阈值下显示速度的比较Fig.1 Comparison of display speed between IRIS and CEM3DDS under different threshold

图2 IRIS和CEM3DDS在不同阈值下信号与噪声的幅度比较Fig.2 Amplitudes of signal and noise of IRIS and CEM3DDS under different threshold

图3 BmCPV与C6/36DNV的三维显示。(a)BmCPV 30°方位角;(b)BmCPV 60°方位角;(c)C6/36DNV 30°方位角;(d)C6/36DNV 60°方位角Fig.3 3D display results of BmCPV and C6/36DNV.(a)BmCPV azimuthalangle30°;(b)BmCPV azimuthal angle 60°;(c)C6/36DNV，azimuthal angle 30°;(d)C6/36DNV，azimuthal angle 60°

图4 BmCPV+mab一半体数据中垂直面的显示。(a)矢状面;(b)冠状面;(c)横断面Fig.4 3D display of a hemispherical volume data.(a)vertical section;(b)coronal;(c)transect

图5 CSBV，BmCPV+mab的三维显示，(a)CSBV，90°方位角;(b)CSBV，－90°方位角;(c)CSBV，0°方位角;(d)CSBV，30°方位角;(e)BmCPV+mab，90°方位角;(f)BmCPV+mab，－90°方位角;(g)BmCPV+mab，0°方位角;(h)BmCPV+mab，30°方位角Fig.5 3D display results of CSBV and BmCPV+mab.(a)CSBV，azimuthal angle 90°;(b)CSBV，azimuthal angle －90°;(c)CSBV，azimuthal angle 0°;(d)CSBV，azimuthal angle 30°;(e)BmCPV+mab，azimuthal angle 90°;(f)BmCPV+mab，azimuthal angle － 90°;(g)BmCPV+mab，azimuthal angle 0°;(h)BmCPV+mab，azimuthal angle 30°

3 讨论

冷冻电镜计算机的三维重构技术包括:样品制备、冷冻电镜成像和数据采集、数据处理、三维结构显示和解释。重构过程非常复杂，往往同样的样品、同样的重构条件，得出不同的重建显示结果。导致重构结果误差的主要因素包括:样品的电子辐射损伤、电子源的空间相干性、病毒图像的低衬度导致确定病毒颗粒的取向和中心的误差，其结果均是在所重构的体数据中包含了病毒的伪结构数据。笔者通过体数据场的数据归并，控制方向矢量求解中的矢量维度，获得了新的病毒显示方法。新方法用于可用单颗粒技术重构的病毒，这种技术要求病毒样品是全同性的。

就显示方法而言，CEM3DDS是由灰度体数据直接显示的，避免了面显示等值面提取带来的误差。同时，通过不同透明度和颜色的设定，可以显示对象内部的结构和特征，其缺点是较表面显示要计算量大。但是，对于生物样品，直接显示技术能提供更重要的结构信息。通过对体数据进行的数据归并，首先对体数据的范围进行了压缩，有利于显示速度的提高;其次使每个图像数据均具有三维体数据的整体信息，使得阈值对噪声的敏感性增强，有利于高效地显示图像信息。与 IRIS explorer方法进行了比较，CEM3DDS在显示速度、阈值噪声响应等方面，均有较大提高。在使用时，IRIS explorer需要设置多个显示参数，一旦参数选择不符合要求，病毒的重要结构将不能显示，尤其对初学者。而在CEM3DDS设计时，已将部分参数设置于程序之中，不需要使用软件在界面上设置。例如，IRIS explorer将三维光照效果的参数均放于用户界面上，供使用者调整，但软件的初学者很难进行正确的选择。而CEM3DDS已经在程序中将光照效果设置好，无需在程序界面中调整光照。另外，新方法CEM3DDS将阈值压缩在0～255之间，而 IRIS explorer的阈值无限定。这说明，在阈值的选择和设置时，CEM3DDS的操作比IRIS explorer要简洁。

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3D Display of High-resolution Virus in Electron Cryomicroscopy Single Particle Reconstruction

LI Jing1*LI Kun-Peng2LIU Zheng2ZHAO Hai-Yan3
1(Department of Medical Engineering of Kunming General Hospital，Kunming 650032，China)
2(State Key Laboratory for Biocontrol，School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China)
3(Department of Ophthalmology，The First People Hospital of Yunnan Provin，Kunming 650032，China)

electron eryo-microscopy;3D display;virus

R318.07

D

0258-8021(2010)04-0632-04

10.3969/j.issn.0258-8021.2010.04.025

2009-09-23，

2010-05-14

国家自然科学基金资助项目(30770540);成都军区医学科研计划课题(MB07026)

*通讯作者。E-mail:li_jingkm@126.com