超微六味地黄汤对孕期被动吸烟胎鼠脑抗氧化能力的影响1)

屈 波,蔡光先,刘柏炎,潘小平,何泽云

脑发育过程中存在着大量神经元的增殖以及凋亡。许多因子参与此过程。临床调查研究表明,被动吸烟者胎儿会出现发育迟缓,表现为体格发育缓慢,而且可能伴随智力发育低下,如弱智、多动症等。Kelsey等[1]调查研究显示,孕妇吸烟者所生婴儿中枢神经系统畸形的发生率增高。给大鼠注射尼古丁溶解液成功地制备出致畸模型,并证实尼古丁是一种神经致畸剂。我国吸烟人数为3.5亿,居世界各国之首,女性吸烟率并不高,但由于男性吸烟率居高不下,超过一半的妇女每日生活在二手烟雾环境中,成为被动吸烟的主要受害人群。因此有必要深入探讨香烟对发育中脑的影响以及相关的防治药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级ICR小鼠50只,雄性25只,体重22 g～25 g;雌性25只,体重20 g～22 g,由上海西普尔-比凯实验动物有限公司提供。实验动物合格证:2003—002。

1.1.2 药物 六味地黄汤处方来源于《小儿药证直诀》,组成:熟地黄240 g,山萸肉120 g,山药120 g,泽泻90 g,牡丹皮90 g,茯苓90 g。药材均购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科,经鉴定符合2005年《药典》标准。超微粉制备由湖南省中医药研究院湖南省超微工程技术中心参考有关标准制备[2]。

分别称取传统六味地黄汤120 g和超微六味地黄汤120 g(其比例如处方)。传统饮片按《药典》要求煎煮,取两次煎液混合,水浴蒸发浓缩为含生药2.0 g/mL。超微饮片按照标准浸泡法[3],即第1次加90℃10倍于药材的水,第2次加90℃5倍于药材的水,各浸泡20 min后,取滤液,用定量滤纸过滤,合并滤液,水浴蒸发浓缩成含生药1.5 g/mL。

1.1.3 试剂 芙蓉牌香烟(烤烟型,焦油含量 15 mg,一氧化碳13 mg,烟碱1.0 mg),常德卷烟厂;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒由南京建成生物有限公司提供。

1.1.4 仪器 WFZ75紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司),北京医疗器械厂GSY型恒温水浴锅;哈尔滨GK2-80振动超微粉碎机;贝克曼低温高速离心机;湖南中医药大学实验动物中心被动吸烟装置。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 孕鼠随机分为5组,每组10只。正常对照组(A组);模型组(B组):孕第 7天开始熏烟;超微六味地黄汤全量组(C组)、超微六味地黄汤 1/3量组(D组)、传统六味地黄汤组(E组):孕第7天开始熏烟灌胃。所有动物于孕19 d处死。正常对照组动物不被动吸烟,不做任何处理,与其他组饲养条件相同。根据课题组前期的工作,C组灌服超微六味地黄汤浸膏27.3 g/kg,每日1次;D组灌服超微六味地黄汤浸膏9.1 g/kg,每日1次;E组灌服六味地黄汤浸膏 27.3 g/kg,每日1次。所有动物灌液量均为0.5 mL。模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.2.2 动物模型复制 动物于18:00时按雌雄2:1合笼,次日8:30取出雌鼠,发现阴道栓者确定孕期为0.5 d,记为E0.5。造模按文献的方法采用被动吸烟法[4],于E7～E10,将小鼠置于特制的密闭容器中(10 L),每天熏烟4次,每次15 min,每只小鼠每次燃烧香烟1.5支,两次间隔为 3 h;至E11～E18,每只小鼠燃烧香烟2支,间隔时间和持续时间同前。

1.2.3 取材和标本处理 各组孕鼠E19取材。10%水合氯醛腹腔麻醉,剪开腹腔,暴露子宫,从游离端分离子宫,取出胚胎,0.01 mol/L PBS冲洗血污。胎鼠取全脑,按照重量体积比用生理盐水制备成10%脑组织匀浆液,4℃3 000 r/min离心10 min后取上清液备用。

1.2.4 SOD和MDA检测 严格按照试剂盒方法操作。在550 nm波长条件下用分光光度计测定其OD值(光密度),并计算SOD的活性:SOD[U/(mg◦prot)]=(OD对照管-OD测定管)/OD对照管÷50%×反应液总量/取样量÷蛋白含量。在532 nm波长处测定其OD值(光密度),再按下式求出MDA生成量:M DA[nmol/(mg◦prot)]=(OD测定管-OD空白管)/(OD标准管-OD标准空白管)×标准品浓度÷蛋白含量。

2 结 果

SOD:与A组相比,B组胎鼠脑SOD下降不明显(P＞0.05),治疗后C组较B组、E组明显升高(P＜0.05)。MDA:与A组相比,B组胎鼠脑MDA明显升高(P＜0.05);治疗后各组MDA均有所下降,C组MDA明显低于B组和D组(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组胎鼠脑组织SOD和MDA比较(±s)

表1 各组胎鼠脑组织SOD和MDA比较(±s)

组别 SOD[U/(mg◦prot)]MDA[nmol/(mg◦prot)]A组 12.228±4.113 0.257±0.149 B组 7.019±2.899 0.684±0.2321)C组 17.450±6.0572)4) 0.153±0.0702)3)D组 10.561±3.468 0.343±0.134 E组 8.888±1.809 0.320±0.165与A组比较,1)P＜0.05;与B组比较,2)P＜0.05;与D组比较,3)P＜0.05;与E组比较,4)P＜0.05

3 讨 论

香烟烟雾中的氧自由基可诱导不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应、蛋白质交联和凝集。胚胎组织富含多不饱和脂肪酸,极易受到氧自由基的氧化损伤引起细胞凋亡。脂质过氧化物可引起细胞内Ca2+显著升高,激活凋亡有关的蛋白(如蛋白磷酸酯碱酶、钙神经碱等),导致 Bax升高,Bcl-2下调,从而诱导凋亡。香烟烟雾损伤胚胎脑神经元细胞的线粒体,导致线粒体内、外膜间的促凋亡因子细胞色素C和凋亡诱导因子释放至胞浆中,通过一系列反应激活Caspase蛋白,引起细胞凋亡。六味地黄汤能降低Caspase-3的活化并抑制Bax升高,阻止凋亡的发生。

中医理论认为生长发育、生殖和机体盛衰均由肾气盛衰所主导。肾为先天之本,肾精是构成人体的基本物质,为生长发育提供原动力。脑为髓海,属于奇恒之腑,为元神之所居。肾与脑的关系为“肾生髓,通于脑”,因此,肾在脑的发育中起着决定性的作用。肾之精气的盛衰直接关系到脑髓的盈亏及大脑功能的正常发挥。肾中精气不足,髓海失养就会形成健忘失眠,反应迟钝,头晕目眩,记忆力减退等髓海不足的病理变化,六味地黄丸可以改善上述病变。说明肾和脑之间有着密切的关系,本实验进一步从现代医学的角度反证了这一论断。

课题组前期的研究已证实:孕鼠被动吸烟可造成胎鼠大脑皮质细胞层次不清,神经元凋亡增多,皮层神经元数量减少,显示脑发育不良,六味地黄汤传统饮片能有效改善上述表现[5]。本研究进一步表明:被动吸烟鼠仔脑组织中 Bax、Bcl-2和Caspase-3表达增加,六味地黄汤超微和传统饮片均能抑制Caspase-3的活化和Bax升高;超微六味地黄汤全量组和超微六味地黄汤1/3剂量组对Caspase-3的效果优于传统六味地黄汤组。

[1]Kelsey JL,Theodors RH,Bracken MB.Maternal smoking and congenital malfo rmations:An epidemiological study[J].J Epidem Community Health,1978,32:103.

[2]蔡光先,杨永华,张水寒.微粉化对人参类药材有效成分的影响[J].中国医药学报,2001,16(6):26.

[3]蔡光先,杨永华,陈燕军,等.银翘解毒汤超微饮片与传统饮片的化学对比研究[J].中国实验方剂学杂志,2002,8(6):5.

[4]张秀泉,严隽鸿,洪素英,等.被动吸烟法建立IUGR动物模型[J].上海第二医科大学学报,1993,13(4):314-317.

[5]蔡光先,刘柏炎,陈奕安.六味地黄汤对宫内发育迟缓胎鼠脑发育的影响[J].中华中医药杂志,2007,22(9):642-644.