载脂蛋白E基因多态性与血管性认知障碍关系的研究

杨丰兵,李新毅,穆俊霞

载脂蛋白E(Apo E)基因位于19q13.2上,3种常见的等位基因ε 2、ε 3和ε 4分别编码产生3种主要的Apo E异构体 Apo E2、Apo E3和Apo E4[1]。Apo E参与机体血脂代谢及调节胆固醇平衡,在动脉粥样硬化的发生和神经损伤的修复中起着重要作用[2],它与血管性认知障碍的关系目前研究很少,有必要对脑梗死病人Apo E基因多态性进行研究,并分析其对认知功能障碍的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取山西医科大学第一医院2009年5月—2009年11月新入院的脑梗死病人240例为脑梗死组,其中男139例,女101例,年龄(67.65±7.86)岁。诊断符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准[3],并经头颅CT/磁共振成像(M RI)确诊;排除栓塞性、感染性因素及其他非血管因素所致卒中,另外除外意识障碍、失语及有精神障碍不能配合认知功能检查的病例。并同期收集山西医科大学第一医院门诊体检中心健康体检者150名作为对照组。其中男92名,女58名,年龄(65.38±7.36)岁。两组年龄、性别差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采集空腹静脉血2 mL,用EDTA-Na2抗凝,用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 引物设计 参照文献[4]方法,用等位基因特异性多重聚合酶链反应(ARMS-PCR)方法检测ApoE基因多态性。设计上游引物序列(由宝生物工程大连有限公司合成):P1,5′-CGCGGACATGGAGGACGT TT-3′,P2,5′-CGCGGACATGGAGGACGT TC-3′,分别检测 ApoE112位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg);P3,5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3′,P4,5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3′,分别 检测 ApoE158位的 Cys和 Arg;设 计 公 共 下 游 引 物 为 P5,5′-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3′;引物 P1与 P5、P2与 P5扩增出的片段为588 bp,P3与P5、P4与 P5扩增出的片段为451 bp。另按照 Newton等[5]方法,设计一对引物扩增α-抗胰蛋白酶(AAT)基因外显子3片段(360 bp),作 为内参照。序列:P6,5′-CCCACCTTCCCCTCTCTCCAGGCATGGg-3′,P7,5′-GGGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGG-3′。

1.2.3 PCR反应体系 总反应体系为25 μ L,每个样本设计1、2、3、4四管。各管均加入10×PCR Buffer(含 18 mmol/L Mg2+)2.5 μ L,5 mmol/L dNTP 2 μ L,Taq DNA 聚合 酶 4 U,DNA 模板 3 μ L,二甲基亚砜(DMSO)2 μ L,公共引物 P5 1 μ L,P6和 P7 各 1 μ L,每管分别加入对应的 P1、P2、P3、P4 1.5 μ L,最后加灭菌三蒸水 11 μ L。

1.2.4 PCR反应条件 95℃预变性5 min,然后按 95℃变性45 s、62℃退火 45 s、72℃延伸45 s,循环 35次,最后 72℃延伸5 min。取 10 μ L PCR产物和6*buffer 2μ L混合后,用浓度为2%的琼脂糖凝胶(已加入goldview)进行电泳后、凝胶成像系统进行图像分析,确定ApoE基因型。电泳条件:0.5×TBE电泳缓冲液恒压100 V电泳30 min。

1.2.5 结果判定方法 每个样本分别设计 1、2、3、4四管,均加入公共下游引物P5,并分别加入上游引物 P1、P2、P3、P4。P1与 P5扩增出 588 bp片段,决定ApoE 112的Cys;P2与 P5扩增出 588bp片段,决定112位Arg;P3与 P5扩增出451 bp片段,决定158位Cys;P4与P5扩增出451 bp片段,决定158位Arg。E2/2型第112、158位均为 Cys,故 1、3管扩增阳性,而2、4管除扩增出360bp内参AAT片段外,无目的片段扩增出;E3/3型第112位是Cys、第158位是Arg,故 1、4管扩增阳性,而2、3管只扩增出360 bp内参片段;E4/4型第112、158位均是Arg,故2、4管扩增阳性,1、3管只扩增出360 bp内参片段;E2/3型1、3、4管扩增阳性,2管只扩增出 360 bp内参片段;E3/4型1、2、4管扩增阳性,第3只扩增出 360 bp内参片段;E2/4型1、2、3、4 管均扩增阳性。

1.2.6 认知功能测评 所有脑梗死病人病情稳定后均进行MM SE及MOCA量表测评。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行分析,基因频率采用基因计数法,基因型及等位基因频率比较用χ2检验。3个基因亚型间评分的比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 ApoE基因各基因型及等位基因分布 ACI组ApoE3/4基因型频率较对照组显著增高(P＜0.05)。ACI组和对照组间等位基因频率有统计学意义(P＜0.05),脑梗死组ε 4频率高于对照组(P＜0.05)。详见表 1。

表1 APOE基因型及等位基因分布 例(%)

2.2 脑梗死组不同ApoE基因亚型M MSE、MOCA评分的比较(见表2)

表2 各APOE基因亚型间MMSE、MOCA比较(±s) 分

表2 各APOE基因亚型间MMSE、MOCA比较(±s) 分

组别 MMSE评分 M OCA量表ε 2 组 27.90±1.101) 26.69±1.311)ε 3 组 24.32±5.951) 23.89±5.031)ε 4 组 20.07±9.23 19.83±10.75与ε 4比较,1)P＜0.05

3 讨 论

Apo E是载脂蛋白家族中重要的成员之一,它参与人体脂代谢调节,与动脉粥样硬化甚至高血压的发生有关。而高脂血症、动脉粥样硬化、高血压病等又是脑血管病的危险因素[6,7]。ApoE在脂蛋白的代谢中起着重要作用,ε 4等位基因与高含量的血总胆固醇(TC)、高浓度的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及高水平的载脂蛋白B显著相关,促进动脉粥样硬化。本实验Apo E4基因在脑梗死组比在对照组有较高的表达率,与大多研究相一致。脑梗死组中ε 4频率明显高于对照组,推断ε 4等位基因可能是脑梗死的遗传标记之一。

血管性认知障碍(VCI)是指由血管因素引起的不同程度的认知障碍[8]。目前已知ApoE4基因型是阿尔茨海默氏病(AD)发病的易感和危险因素之一[9]。本研究显示ApoEε 4基因携带者认知功能(MMSE及 MOCA评分)明显低于ε 2、ε 3携带者。与我国流行病学调查显示携带ApoEε 4基因的健康老年人随着年龄的增加更易出现认知功能的障碍相一致。因此,可以推测ApoEε 4基因为 VCI的危险因素,但其导致认知功能下降的机制可能不单纯是增加血管性风险,还有其他机制,如对神经元损伤后修复的影响。

ApoE是神经系统中髓鞘磷脂代谢重要因子,而髓鞘磷脂代谢与神经元损伤后的修复过程密切相关。缺血性及创伤性所致的神经变性和再生时,星形细胞或临近巨噬细胞释放ApoE量增加 ,促进胆固醇酯化从而为轴突膜的生长提供脂质,利于神经元的生长及神经树突重建。而这一作用被证实是E3单体特异性的,而E4却无此特异作用[10]。E4可能会加重神经变性或血管性原因造成的脑损伤修复困难,从而在认知障碍的发生中起消极作用。ApoE4基因可能为VCI的危险致病因子,但具体作用机理尚待进一步研究。

但是,ApoEε 4在对血管性认知障碍的作用机制至今尚不完全明确,可能与下列因素有关:①引起血脂代谢紊乱,促进动脉粥样硬化;②刺激巨噬细胞及泡沫细胞的形成,作用于脂蛋白的结构蛋白能直接参与动脉粥样硬化的形成;③ε 4抗氧化能力弱于ε 3,ε 4对缺血性神经元损伤的保护性作用较差;ε 4基因携带者神经细胞缺血性损伤的程度较重;④ε 4可阻止神经细胞损伤后神经功能的恢复。

ApoEε 4等位基因对认知功能产生有害影响,因此,通过检测ApoE基因型能够早期发现发现VCI的高危人群,为早期干预VCI创造条件,从而减轻VCI对家庭和社会的危害。

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