花生壳提取物的三种体外抗氧化方法的综合比较

杨颖，宋曙辉，王文琪，徐桂花

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川750001；2.国家蔬菜工程技术研究中心，北京100097）

花生壳提取物的三种体外抗氧化方法的综合比较

杨颖1，2，宋曙辉2，王文琪2，徐桂花1

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川750001；2.国家蔬菜工程技术研究中心，北京100097）

采用DPPH、TBA和Xan-XOD 3种体外评价方法评价花生壳提取物的抗氧化活性，结果表明，在这3种抗氧化评价体系中，花生壳提取物均显示了良好的抗氧化性能，DPPH中IC50为7 μg/mL,大豆油中IC50为0.017%，亚麻油中为0.027%，花生油中为1.19%,Xan-XOD中IC50为0.2 mg/mL。

花生壳提取物；木犀草素；DPPH；TBA；Xan-XOD；抗氧化

Abstract:Three different systems including DPPH scavenging method,TBA and Xan-XOD were used to investigate the antioxidant activity of peanut hull extract.The results showed that the extract had high antioxidant activity in these evaluation systems.In DPPH the IC50is the 7 μg/mL,In TBA the IC50is the 0.017%for soybean oil,the 0.027%for linseed oil,the 1.19%for peanut oil,in Xan-XOD the IC50is the 0.2 mg/mL.

Key words：peanut hull extract；Luteolin；DPPH；TBA；Xan-XOD；antioxidant

抗氧化的评价方法有体内和体外两种方法，体内评价多采用动物，如大鼠和小鼠进行体内抗氧化酶类的评价，抗氧化酶一般是取超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，以及尿酸、谷胱甘肽、VC、类胡萝卜素、生育酚和辅酶Q10等。体外抗氧化能力的测定方法主要有ABTS法、DPPH法、FRAP法、ORAC法、PCL法等；目前常用来测定抗氧化活性方法的原理主要基于两类[1]：一是对人工合成自由基的清除（如·OH、超氧阴离子自由基、二苯代苦味酞基自由基等）；二是在特定环境下，对测试体系中脂类物质氧化抑制能力的测定（如：硫氰酸铁法FTC法、硫代巴比妥酸反应物TBARs法）。

花生壳中含有较高的木犀草素。木犀草素作为一种天然黄酮化合物具有抗氧化功能，本研究主要是运用清除DPPH·、·OH及抑制脂质过氧化等3种抗氧化评价方法对花生壳提取物的抗氧化能力进行评价，使花生壳资源能够得到更好的开发利用。

1 材料与方法

1.1 设备

离心机：飞鸽牌TDL-40B；分析天平：岛津LM-20,百万分之一；UV-2550紫外分光光度计：日本岛津。

1.2 试剂

木犀草素标准品、二苯代苦味肼基（DPPH）、黄嘌呤（Xanthine）、羟胺（HONH2）、黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase,XOD）、对氨基苯磺酸(sulfanilic acid)、萘乙二胺（NED）均购自 Sigma；芦丁、槲皮素、抗坏血酸、2.6－二叔丁基对甲酚（BHT）、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯甲烷、磷酸盐缓冲液（PBS：磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、盐酸、无水乙醇、甲醇均为分析纯。

1.3 花生壳提取液的制备

取烘干粉碎的花生壳粉，70%乙醇提取，提取液离心，取上清液备用，其浓度均为溶液中的木犀草素的浓度。

1.4 方法

1.4.1 清除DPPH·的能力测定

1.4.1.1 测定原理

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有一个孤对电子，呈现紫色。若受试物能清除它，则表示受试物具有清除自由基的作用，是一种筛选自由基清除剂的简便方法，国内外将其广泛用于清除自由基的研究[2]。该方法的原理是[3]：DPPH·在517 nm波长处有最强吸收呈深紫色，当DPPH·溶液中加入自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使溶液颜色变浅，吸收逐渐消失，其退色程度与其所接受的电子数成线性关系，因而可用分光法进行测量，从而评价试验样品的抗氧化能力。

1.4.1.2 测定方法

称取一定量的DPPH·，配成0.2 mmoL/L的DPPH溶液，于冰箱中冷藏保存，按照表1的方法加入制备好的花生壳提取液测定清除DPPH·的能力。

表1 DPPH·试验加样表Table 1 DPPH test plus sample table

式中：A0为双蒸水与DPPH溶液反应的吸光值；A样：样品溶液与DPPH溶液反应的吸光值；A空：样品溶液与乙醇溶液反应的吸光值。

1.4.2 抗油脂过氧化力的测定[4]

1.4.2.1 测定原理

油脂发生过氧化反应从其化学本质来讲,主要是油脂中含有不饱和脂肪酸,尤其是亚油酸和亚麻酸上含有的1,4戊二烯结构使它们对氧化的敏感性远远超过油酸中丙烯体系,这种氧化作用又受到金属离子如Fe2+、Cu2+的催化,氧化反应一旦被启动,很容易形成链式反应,加速油脂的氧化酸败。抗氧化剂作为氢给予体和自由基接受体起着抑制链式反应的作用,从而使油脂过氧化反应的发生受到一定的限制。该方法的原理是[5]：丙二醛是油脂被氧化后的产物,它可以与硫代巴比妥酸反应生成有色产物可在532 nm下测定出其吸光值,吸光度值表示油脂氧化程度,其值越大,氧化程度越严重，当油脂中加入抗氧化剂时，就会减少氧化反应的发生从而降低丙二醛的含量。

1.4.2.2 测定方法

称取1 g油样，加入一定量的花生壳提取物，于烘箱中45℃下恒温24 h，取烘过的混合油样1 mL加入2 mL 20%的TCA和2 mL 0.6%的TBA在沸水浴下20 min，取出冷却后加入5 mL三氯甲烷，充分混匀，离心后取上清液比色，在532 nm下测定其吸光度。按以下公式计算抑制率。

加好样后摇匀，于室温下静置30 min后，分光光度计测定其吸光值。按以下公式计算清除率，并通过软件计算出IC50值。

式中：A空为以蒸馏水代替样品不经烘箱处理的吸光值；A0为以蒸馏水代替样品经过烘箱处理的吸光值；A为样品管的吸光度值；A及A0计算时均需分别减去各自平行的空白即A空。

1.4.3 在Xan-XOD系统中的抗氧化力的测定[6]

1.4.3.1 测定原理

以羟胺为指示剂，以黄嘌呤为底物，黄嘌呤氧化酶可产生超氧阴离子自由基(O2-·)和过氧化氢（H2O2），二者可进一步反应生成羟基自由基（·OH）。·OH将盐酸羟胺氧化生成亚硝酸盐，后者可通过与对氨基苯磺酸与萘乙二胺的反应而被分光光度法检出。而抗氧化剂可通过抑制XOD酶的活性，或清除O2-·、H2O2、·OH等自由基以及抑制盐酸羟胺的氧化而减少亚硝酸盐的生成。

1.4.3.2 测定方法[7-8]

精确配制 0.1 mol/L 的 PBS，pH=7.4，1 mmol/L 的HONH2·HCl,0.5 mmol/L 的 Xanthine,0.04 U/mL XOD。将上述溶液以及稀释为不同浓度的花生壳提取液按表2依次加入到试管中，37℃下水浴振荡30 min。取出后取0.3 mL迅速加入0.3 mL 1%sulfanilic acid以及0.3 mL0.02%的NED后在540nm下测定其吸光度。

表2 NH2OH-Xan-XOD试验加样表Table 2 NH2OH-Xan-XOD plus sample table experiment

1.5 数据分析

每个试样测定2个平行试验，结果取平均值。所有数据采用Excel和origin7.5进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 清除DPPH·试验

清除DPPH·试验，见图1。由图1可知，花生壳提取物清除DPPH·的能力与BHT基本相当，低于芦丁和Vc的清除能力。IC50从小到大依次为：VC的0.5 μg/mL＞芦丁的 1.45 μg/mL＞花生壳提取物的 7 μg/mL＞BHT 的 10.2 μg/mL。

图1 花生壳提取物与其它几种抗氧化剂清除DPPH·的比较Fig.1 Peanut hull extract and several different antioxidants Comparison of Removal DPPH radical

2.2 抗油脂过氧化试验

2.2.1 花生壳提取物在不同油脂中的抗氧化效果

花生壳提取物在不同油脂中的抗氧化效果见图2。

图2 花生壳提取物在不同油脂中的抗氧化效果Fig.2 Anti-oxidant of peanut hull extract effect on different oils and fats

由图2可知：随着花生壳提取物添加量的增加，其对油脂过氧化力的抑制率增大，在大豆油和亚麻油中的抑制油脂氧化的能力要强于在花生油中，计算IC50，在大豆油中的有效添加量（抑制50%过氧化反应时的添加量）为0.017%，在亚麻油中的为0.027%，在花生油中的为1.19%。由于花生油中的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸的含量要高于大豆油和亚麻油，所以抑制其氧化的IC50要大于大豆油和亚麻油。

2.2.2 花生壳提取物和BHT在亚麻油体系中的抗氧化比较

花生壳提取物和BHT在亚麻油体系中的抗氧化比较见图3。

由图3可知，在亚麻油评价体系中，花生壳提取物抑制能力明显高于BHT，其IC50分别为0.027%、0.12%。在相同的添加量条件下，花生壳提取物的抑制率平均为BHT的1.5倍。

2.3 NH2OH-Xan-XOD系统抗氧化试验

花生壳提取物和VC在NH2OH-Xan-XOD系统中的抗氧化能力比较如图4和图5所示。

图3 花生壳提取液和BHT在亚麻油中的抗氧化效果的比较Fig.3 Peanut hull extract and BHT in the antioxidant effects of linseed oil with comparison

图4 VC在NH2OH-Xan-XOD系统中的抗氧化效果Fig.4 Antioxidant of VCeffect on NH2OH-Xan-XOD system

图5 花生壳提取物在NH2OH-Xan-XOD系统的抗氧化效果Fig.5 Antioxidant of peanut shell extract effect on NH2OH-Xan-XOD system

由图4和5可知，花生壳提取物在0.02 mg/mL～0.45 mg/mL范围内亚硝酸盐的生成明显减少，即·OH的生成被抑制，其IC50为200μg/mL，VC的为7.85μg/mL，花生壳提取物中因含有其他物质或杂质等，故清除·OH的能力要低于纯品VC。

3 结论

抗氧化的作用可以通过多种途径来进行评价，不同的评价系统其原理不相同。通过3个抗氧化模型系统对花生壳提取物进行评价，包括涉及人工合成的自由基的清除、对·OH的抑制及过氧化产物的抑制等。3种抗氧化方法虽然不能相互比较，但可以反应出花生壳提取物在不同体系中的抗氧化作用，如图6所示。

图6 花生壳提取物的3种抗氧化方法的综合比较Fig.6 Comparison with three methods of vitro on antioxidant of peanut hull extract

结果表明：

1）在清除DPPH·试验中，花生壳提取物有优于BHT的抗氧化效果，其 IC50为7 μg/mL；

2）在抗油脂过氧化试验中，花生壳提取物均表现出较高的抗氧化能力，在抑制亚麻油脂质过氧化试验中，其抗氧化效果明显高于BHT，其IC50大豆油中为0.017%，亚麻油中为0.027%，花生油中为1.19%；

3）在NH2OH-Xan-XOD系统中的抗氧化能力试验中，花生壳提取物的IC50在200 μg/mL，具有清除过氧化氢、超氧自由基和·OH的能力。

花生壳提取物的抗氧化能力与其中所含的木犀草素成正相关。随着木犀草素含量的增加，抗氧化的能力增强，由此表明花生壳提取物中主要的抗氧化物质为木犀草素。

[1]付陈梅,焦必宁,阚建全.果蔬总抗氧化能力间接测定法及其影响因素[J].食品科学，2008，29(4)：457-460

[2]许申鸿，杭瑚.DPPH·分光光度法测定抗坏血酸[J].食品科学，1999，7：55-57

[3]Collins M A,Charles H P.Antimicrobial activity of carnosol and ursolic acid：two antioxidant constituents of Rosmarinus officinalisL[J].Food Microbiology,1987,4：311-315

[4]沈建福，张英.竹叶黄酮糖苷的水解及其苷元的抗氧化性能研究[J].中国粮油学报，2001,16(4)：14-16

[5]杨淑珍,张友胜,彭丽桃,等.二氢杨梅树皮素的抗氧化效果研究[J].中国粮油学报,2004,19(2)：82-84

[6]Janisch K,Hippeli S,Dornisch K，et al.Determination of the antioxidative potential of human plasma after supplementation with pycnogenol and whey[J].Food Res Int，2002,35：257-266

[7]Schempp H，Weiser D，Elstner EF.Biochemical modelreactions indicative of inflammatory processes.Activities of extracts from Fraxinus Excelsior and Populus tremula[J].Arznelmittel-Forschung，2000,50：362-372

[8]Halliwell B，Gutteridge JMC.Free Radicals in Biology and Medicine[M].Third edition：Oxford Univesity Press,1999：120-121

The Study in Comprehensive Comparison with Three Methods of Vitro on Antioxidant of Peanut Hull Extract

YANG Ying1，2,SONG Shu-hui2,WANG Wen-qi2,XU Gui-hua1
（1.Agriculture College，Ningxia University,Yinchuan 750001,Ningxia,China；2.National Engineering Research Center for Vegetables,Beijing 100097，China）

2009-09-16

杨颖（1985—），女（汉），在读研究生，主要从事功能性成分的提取及食品安全检测方面的研究。