乳铁蛋白肽的抑菌活性及其基因工程制备*

巴特，丁卓平，刘承初

(上海海洋大学食品学院，上海，201306)

乳铁蛋白肽的抑菌活性及其基因工程制备*

巴特，丁卓平，刘承初

(上海海洋大学食品学院，上海，201306)

乳铁蛋白肽是乳铁蛋白在酸性条件下经胃蛋白酶裂解，从N端释放的具有两亲性的阳离子多肽，具有广谱抗菌活性。目前，乳铁蛋白肽主要是通过水解乳铁蛋白来获得，无法大规模生产，基因工程技术将是大规模生产乳铁蛋白的最佳途径。文中对乳铁蛋白肽的抑菌活性及其转基因生产技术(包括表达系统的选择与比较，基因工程菌发酵液中乳铁蛋白肽的分离和纯化等)进行了简要的综述。

乳铁蛋白肽，抗菌肽，基因工程

乳铁蛋白(lactoferrin)是一种非血红素铁结合糖蛋白，与血清转铁蛋白、卵转铁蛋白和黑素转铁蛋白一样属于转铁蛋白科，由哺乳动物黏膜上皮细胞分泌，分子质量约为80 ku[1-2］。乳铁蛋白约含690个氨基酸，不同种类的乳铁蛋白氨基酸序列具有非常高的同源性，其二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成，其中人和牛乳铁蛋白二级结构中α-螺旋多于β-折叠[2］，并在二级结构的基础上折叠成两个对称的具有相似结构的球状叶(N-叶和C-叶)，两叶氨基酸序列具有40%的同源性，同时各具有一个铁离子结合位点[3-4］。乳铁蛋白的诸多生理功能均与其可逆鳌合Fe3+和能通过特殊的受体连接到细胞表面的特性有关[4-5］，其生理功能主要有广谱抗菌、抗过敏、参与免疫调节和抗炎症作用、促进细胞生长、抗血小板凝集、抑制半胱氨酸蛋白酶等[6-9］。乳铁蛋白主要分布于多种哺乳动物(除大鼠、兔和狗外)的白细胞和多种组织外分泌液中，如乳汁、泪液、胆汁、黏膜液、唾液等，其中乳汁中含量最为丰富，其含量仅次于酪蛋白，其中人乳中含量约为1.0～3.2 mg/mL，猪、豚鼠、小鼠和马乳中含量约为0.2～2.0 mg/mL，牛乳、山羊乳中约0.02～0.2 mg/mL。此外，乳汁中的含量与泌乳时间存在一定的负相关性，初乳中含量高达7 mg/mL，随着泌乳时间的延长其含量逐渐降低[4，10-14］。

乳铁蛋白肽(lactoferricin，Lfcin)是乳铁蛋白在酸性条件下经胃蛋白酶裂解，从N端释放的具有两亲性的阳离子抗菌肽[15-17］，Lfcin含有25个氨基酸，多肽链通过二硫键连接成环状，它不易被蛋白酶进一步酶解，除不能参与铁代谢外，具备完整乳铁蛋白的所有生物学活性，如抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节、调控基因表达等[18-19］，虽然其抗病毒能力弱于完整乳铁蛋白[13］，但其抗菌性远强于完整的乳铁蛋白。

1 乳铁蛋白肽抗菌功能

Abe等[20］在研究脱铁型乳铁蛋白在酸性条件下的热稳定性时，发现在pH值2.0～3.0条件下100℃加热5 min，LF明显发生了降解，然而其抗菌活性却有所增加，于是推测LF中存在耐热的抗菌活性多肽。Tomita等[21］研究了牛乳铁蛋白的蛋白酶水解物的抗菌效果，结果表明:猪胃蛋白酶、鳕鱼蛋白酶、酸性蛋白酶水解得到的小分子多肽具有较强的抗菌作用，其抗菌活性是未降解前的8倍以上。此后，Bellamy等[15］分别在人、牛乳铁蛋白N端附近分离到一条多肽，其抗菌活性分别是人乳铁蛋白的2倍、牛乳铁蛋白的12倍，即乳铁蛋白肽，其中牛乳铁蛋白肽抗菌能力是人乳铁蛋白肽的9倍。Lfcin抗菌能力主要表现为广谱的抑菌和杀菌作用[15，22］。Bellamy等[23］研究了牛乳铁蛋白肽(LfcinB)的抗菌谱(表1)，所选择的菌株包括G+和G-、杆菌和球菌、专性需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌。

由表1可知:LfcinB除对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粪肠道球菌(Entercoccus faecalis)没有抑菌作用外，对其他生长的检测菌株均有不同程度的抑制作用，抑菌效果与培养基和细菌种类有关，其抑菌浓度范围在0.6～45 μg/mL，且G+对LfcinB更为敏感。

除细菌外，Lfcin，特别是LfcinB也能有效抑制一些酵母、霉菌及丝状真菌的生长，如白色假丝酵母菌(Candma albicans JCM 2900)、隐球酵母菌(Cryptococcus uniguttulatus JCM 3685)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus JCM 1917)、青霉(Penicillium pinophilum JCM 5593)、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes IFO 5466)等[24-25］。

食品安全是关系国计民生的大事，全天然绿色抑菌剂的开发与应用是中国乃至世界的前沿课题。乳铁蛋白是一种天然存在，广泛分布于人和家畜乳汁、唾液、眼泪等外分泌液的铁结合糖蛋白，具有安全无害的特点。乳铁蛋白及其水解产物具有高效、广谱的抗菌活性已得到科学验证，经过去铁饱和度和固定化处理等特殊工艺活化的乳铁蛋白(ActivinTMAcivated Lactoferrin®，aLF Ventures，LLC)，已作为一种安全高效的抑菌剂被美国FDA批准应用于牛肉的保鲜与抑菌。乳铁蛋白肽是由乳铁蛋白经蛋白酶降解产生的，具有比乳铁蛋白更强的抗菌活性，且不易产生抗药性、对真核细胞几乎没有毒性，是一种具有广阔应用前景的新型抗菌肽，然而天然分离Lfcin产量低、工艺复杂，成本昂贵，而人工合成Lfcin费用更高，无法大规模生产，从而制约乳铁蛋白肽的广泛应用。随着现代生物技术的发展，利用转基因技术大规模生产乳铁蛋白肽将是解决工业用Lfcin来源不足最有效的途径。

2 采用基因工程技术制备乳铁蛋白肽

由于生物体内乳铁蛋白含量比较低，不能满足大规模商业化的需要，转基因技术是能够大规模生产活性蛋白的有效途径，目前已有许多学者克隆了人、牛和猪乳铁蛋白肽基因，并在细菌、真菌、植物和动物细胞中成功表达，基因工程技术生产重组蛋白的流程主要有合成目的基因、构建重组质粒、质粒转化宿主、重组蛋白的表达及目的产物的分离纯化，而目的基因的合成、重组质粒的构建及目的蛋白的纯化过程也因表达系统的不同而有所差异，目前所采用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、真菌表达系统、动植物表达系统。

2.1 大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统可以大规模表达目的蛋白、生长周期短，并且外源DNA容易转化至大肠杆菌中、DNA需要量少，因此Lfcin基因工程制备方面的研究大多数集中采用大肠杆菌表达系统，但由于Lfcin对细菌的杀伤作用，不能用大肠杆菌直接表达具有生物活性的Lfcin，而需采用融合蛋白的形式表达[26］。罗红霞等[27］对鲁西黄牛乳铁蛋白肽基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌活进行了研究，结果显示，重组乳铁蛋白肽对大肠杆菌(E.coli C84010)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 184)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和变形链球菌(Streptococcus mutans)均有抑菌活性。Feng等[28］和Tian等[29］根据大肠杆菌E.coli偏爱的密码子，化学合成编码LfcinB的氨基酸片段，通过质粒转化至大肠杆菌中成功表达了乳铁蛋白肽，重组的Lfcin可以抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)的生长。Kim等[26］研究了乳铁蛋白肽与阴离子肽在大肠杆菌中的融合表达，此项研究采用PCR技术将乳铁蛋白肽与改良过的滑爪蟾素结合，使原本具有碱性特征的乳铁蛋白肽中和至酸性，融合基因在大肠杆菌DE3中表达，每升细菌培养物中可获得60 mg纯化的乳铁蛋白肽，并且具有生物活性。邓强等[30］根据大肠杆菌偏爱的密码子设计了牛乳铁蛋白肽的3段引物序列，通过PCR合成并经双酶切后克隆入pED质粒的BamHI和HindsIII位点之间，构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体，转化至E.coli BL-21(DE3)中获得牛乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆茵经乳糖诱导后，可表达出数量可观的融合蛋白，且表达量与诱导时间呈一定相关性，经检测重组牛乳铁蛋白氨基酸序列与天然乳铁蛋白肽完全一致。

上述研究均采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法来检测重组蛋白的表达。融合表达是目前运用原核系统进行的Lfcin基因工程研究的主要方式，虽然Lfcin与其它基因融合后均能得到表达，也显示了生物活性，但大肠杆菌表达系统不能对乳铁蛋白肽进行正确的糖基化等加工后修饰工作，适用于生产不需糖基化等翻译后加工修饰的重组蛋白[31］。

2.2 真菌表达系统

利用原核生物——大肠杆菌作为宿主菌生产外缘蛋白技术已相当成熟，有不少已经发展到工业规模，但大肠杆菌合成的外源蛋白大多已以包涵体形式存在于细胞内，且不能对真核蛋白进行糖基化等翻译后修饰工作，因此很难直接得到具有生物活性的真核蛋白。真菌表达系统作为低等真核生物，具有与哺乳类细胞相似的翻译后加工修饰功能，与哺乳动物细胞表达系统相比，它可以在简单的培养基上快速生长，是真核基因外源表达的理想宿主，目前已有多种真核蛋白在真菌表达系统成功表达[9，32-33］。酵母和丝状真菌是目前用于表达真核蛋白的常用载体。

酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制，冯永潜等[34］化学合成了Lfcin B基因序列，实现了其在酿酒酵母中的表达，该研究证实了目的蛋白的表达及其抑菌活性，但未对表达量作进一步的研究，酿酒酵母已被广泛用作外源蛋白的表达宿主，为基础研究和疫苗产业化作出了巨大贡献，但是存在外源基因不稳定、表达质粒易丢失和蛋白质过度糖基化等局限性。毕赤酵母是一种以甲醇为唯一碳源和能源的低等真核生物，能高水平分泌表达外源蛋白，并对其进行正确的翻译后加工修饰，并且不会产生内毒素，同时具有在特定条件下高密度生长的特性，是基因工程中良好的真核基因受体菌，已成功表达了从人内抑制素到蛛拉丝蛋白近400种蛋白[35-37］。马凤龙等[38］将化学合成的LfcinB编码基因转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中成功表达了LfcinB，证明利用化学合成法直接合成的编码Lfcin B的DNA构建真核表达载体、通过生物发酵工程来制备LfcinB是可行的。

由于酵母是比较低等的真核生物，虽然能表达、分泌外源蛋白及翻译后修饰加工，但表达水平普遍偏低，修饰模式也与高等真核生物存在很大差别，丝状真菌可以弥补酵母表达系统的一些不足，丝状真菌既可以大量分泌各种外源蛋白，使人们得到大量胞外生物活性蛋白，又可以对真核蛋白进行较正确的肽链剪切和糖基化等后加工修饰，且蛋白质糖基化模式与高等真核生物模式非常相似，与其它表达系统相比，成本较低，从而成为一种理想的表达重组蛋白的宿主[39］，目前可用于表达重组蛋白的丝状真菌有黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、Chrysosporium lucknowense、Fusarium graminearum、Trichoderma reesei[40］。

2.3 植物表达系统

植物作为高等真核生物，具有与动物细胞相似的结构和功能，能正确表达和大规模生产外源蛋白，特别适用于具有复杂翻译后加工修饰过程的异源蛋白，如糖蛋白。同时人类在植物栽培、繁育等方面已形成较为完备的理论与技术体系，省去了昂贵的发酵设备和厂房投资，同时也减少了培养基和能源消耗，降低了生产成本，据报道植物表达系统的生产成本仅为微生物发酵系统的2%～10%、动物细胞表达系统的0.1%左右，且植物中不含潜在的人类病源体，不易被哺乳动物病毒、血传病原体、致癌基因等所污染，产品安全，因此利用植物生产外源蛋白展现了极其诱人的前景[41-43］。目前可用植物表达系统生产的外源蛋白包括抗体、疫苗、生物酶、血清蛋白、葡萄糖脑苷脂酶、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、荷尔蒙和生长调节素等[44-45］，采用的植物宿主主要有烟草、马铃薯、番茄、玉米、水稻、小麦、大豆、豌豆和香蕉等[46-48］。

2.4 动物表达系统

昆虫表达系统具有与高等真核生物相似的翻译后加工修饰能力，利用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达外源蛋白是目前普遍采用的方法，另一类建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础上的新型表达系统，在稳定性和表达效率方面有着更为突出的优点。昆虫表达系统具有比哺乳动物细胞表达系统更高的表达效率以及更好的产品安全性，目前已经利用昆虫表达系统成功地生产了鼠源单克隆抗体、人-鼠嵌合抗体、单链抗体及人单克隆抗体等多种抗体分子[31，49-50］。Nakamura等[51］用昆虫细胞克隆表达了牛乳铁蛋白N端部分，虽然编码LfcinB的基因序列发生了一处突变，但是并没有使LfcinB氨基酸序列发生变化，重组LfcinB对E.coli O111具有抗菌性，这也证明采用昆虫细胞大规模表达重组乳铁蛋白肽是可行的。

由于原核细胞缺少内质网和高尔基体等用于糖基化修饰的结构和机制，所表达产物为非糖基化蛋白，并常常以包涵体形式存在;酵母、植物及昆虫等真核细胞虽能对目的蛋白进行糖基化修饰，但其糖基化方式与人类等哺乳动物细胞仍存在差别(各种表达系统优缺点的比较见表2)。哺乳动物细胞表达系统最主要的优点是它可以识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，研究表明，目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同，因此利用哺乳动物细胞和转基因动物高效表达Lfcin也成为生产具有各种生物活性的的重组Lfcin的有效途径。张锦霞等[52］通过PCR扩增获得LfcinB基因，并在山羊和奶牛乳腺中成功表达了具有生物活性的LfcinB，开辟了一条生产LfcinB的新途径，这为LfcinB的研究和应用奠定了基础。

表2 各类表达系统的比较

由于表达系统的不同，融合蛋白的分离纯化过程也有所不同:采用大肠杆菌和酵母表达系统表达的Lfcin的分离纯化过程主要为:菌体收集、细胞裂解、包涵体的分离和裂解、Lfcin的纯化[34，29］。Lfcin的纯化可以采用盐析和有机溶剂沉淀法粗提，但制备高纯度的重组蛋白需采用离子交换、HPLC和亲和层析中的一种或几种方法共同使用。

从植物细胞表达系统中分离目的蛋白是一项昂贵、技术要求较高的工作，需要沉淀、吸附、色谱分离和过滤等复杂的分离步骤。乳腺生物反应器的的蛋白分离纯化过程简单，乳品生产已具有成熟的技术和设施，早已实现机械化，乳汁内源成分相对简单，通过传统的制酪技术去除奶中的酪蛋白之后，目的产品留在乳清中，一般的纯化工艺就能获得纯度较高的产品。

本实验室曾采用大肠杆菌表达系统(E.coli BL21(DE3))成功表达了鲑鱼精蛋白等生物活性肽，我们根据大肠杆菌偏爱的密码子设计了牛乳铁蛋白肽的3段引物序列，通过PCR合成构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体，转化至E.coli BL-21(DE3)中，成功构建了表达牛乳铁蛋白肽的基因克隆菌，经乳糖诱导7 h后融合蛋白表达量达48%。由于大肠杆菌表达分泌的外源蛋白是以包涵体的形式存在，所以LfcinB的分离纯化过程包括包涵体的分离、融合蛋白的分离、融合蛋白的酸水解和柱层析4个过程，实验流程如图1所示。上述流程可分离得到纯度为81%的牛乳铁蛋白肽，得率为41.5 mg/L发酵液。

图1 Lfcin分离纯化流程

由于乳铁蛋白为乳汁等分泌液中天然存在的活性物质，人们在食用乳及乳制品时即能摄入体内时，也会在胃蛋白酶的作用下水解成Lfcin B，因此乳铁蛋白及其水解产物可以作为天然物质添加到食品中，不必担忧其本身的食用安全性，加之其具有广泛而独特的功能特性，美国、澳大利亚、日本等国早在20世纪70年代就已投入巨大的人力、物力进行了深入研究，为其商业化开辟了十分诱人的前景。目前Lfcin主要通过水解乳铁蛋白来获取，但分离乳铁蛋白工艺复杂、产量低、成本昂贵，乳铁蛋白是新西兰出口的最昂贵的奶制品之一，通常从1.4万t原奶才能提取1 t乳铁蛋白，因此它的售价高达NZ$500，000/t(约34万美元)，由此可知通过水解乳铁蛋白来获得Lfcin成本将更加昂贵，所以利用基因工程技术大量表达Lfcin，以用于临床治疗和预防某些病原微生物的感染，将是最具有开发价值的一个选择。目前可以采用细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达系统表达生产重组蛋白，并且每种表达系统均具有各自的优缺点，如生长周期最短的为大肠杆菌表达系统，但其加工后修饰功能最弱;成本最低及最易扩大化生产的为植物表达系统，但生长周期太长、表达过程不易调节;加工后修饰功能最好、最易调节的为哺乳动物细胞表达系统，但其成本过高、不易大规模生产[61，64］。因此选取最适宜于商业化生产的的表达系统要取决于诸多因素，如实验条件、生产成本、生产效率、目的蛋白生物学活性是否有与天然产品存在差异和产品安全性和稳定性等等。

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ABSTRACTLactoferricin is an amphipathic，cationic peptide with stronger anti-microbial activity than lactoferrin.It was mainly generated by the pepsin-mediated digestion from N-terminal of lactoferrin in small scale，Genetic engineering will be the best method to produce lactoferricin.This paper gives an overview on antimicrobial activities of lactoferricin and its production by genetic engineering including the selection and comparision of expression systems，isolation and purification of lactoferricin from the fermented broth of genetic engineering bacteria.

Key wordsLactoferricin，antibacterial peptides，genetic engineering

Overview on Antimicrobial Activities of Lactoferricin and Its Genetic Engineering Production

Bate，Ding Zhuo-ping，Liu Cheng-chu
(College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

硕士研究生(刘承初教授为通讯作者)。

*上海市教育委员会科研创新项目(09ZZ166)，上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)

2009-12-21，改回日期:2010-04-07