加盐量对固态发酵鱿鱼废弃物的影响及其动力学研究*

张建友，姜艳喜，丁玉庭

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州，310014)

加盐量对固态发酵鱿鱼废弃物的影响及其动力学研究*

张建友，姜艳喜，丁玉庭

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州，310014)

采用控温、加曲、低盐杀菌工艺结合固态发酵技术对鱿鱼废弃物进行再加工利用，以减少环境污染并高效利用蛋白资源。综合考虑固态发酵过程中的蛋白酶活力、氨基态氮含量、总酸含量、挥发性盐基氮(TVB-N)含量等指标来研究最佳的发酵工艺。结果表明，8 g/100 g(原料)加盐量下，氨基氮、TCA可溶性氮(TCA-N)、总可溶性氮(TSN)较高，TVB-N含量较低，丙二醛含量(TBARS值)较低，确定8 g/100 g(原料)加盐量为最适宜的发酵加盐量。同时采用ORIGIN7.5软件得到了氨基氮生成动力学模型，在一定程度上揭示了发酵的基本特征，用来预测发酵液中氨基氮浓度。

米曲霉，加盐量，鱿鱼废弃物，固态发酵

鱿鱼加工中大约会产生鱿鱼本身体重50%的废弃物，这些废弃物的随意处置可能会导致资源浪费以及环境污染等问题[1］。近年来，伴随着我国鱿钓业以及沿海地区鱿鱼加工业的快速发展，如何利用这些废弃物已经成了当务之急[2］。笔者探讨了利用米曲霉发酵鱿鱼废弃物产风味前体物质的工艺技术路线，为今后鱿鱼废弃物再利用提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

米曲霉3042、豆粕、麸皮，杭州市食品酿造有限公司。

鱿鱼废弃物，中国水产舟山海洋渔业有限公司，实验室贮藏于-20℃冰柜中。

1.2 实验仪器

CR21GⅡ高速冷冻离心机，日本日立公司;752N紫外可见分光光度计、PHS-3CpH计，上海精科实业有限公司;450Watt食品调理机4162，德国博朗有限公司;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司;98-Ⅱ型强磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司;SW-CJ-2FD双人单面超净工作台;BSP-250生化培养箱、YXQ-LS-50立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 米曲霉3042的活化培养

以无菌操作方式，将4℃冰箱保藏菌种米曲霉3042转接于试管豆汁斜面培养基上，30℃生化培养箱内培养96 h(根据生长情况以及菌种的保藏时间可以选择进行2代或者3代活化培养)。

1.3.2 米曲霉3042的扩大培养

以无菌操作方式，将活化好的菌种转接于茄子瓶豆汁斜面培养基上，30℃生化培养箱内培养96 h。

1.3.3 制种曲

采用100 mL三角瓶培养m(豆粕)∶m(鼓皮)=1∶3，水分含量52%，121℃灭菌30 min)，将扩大培养的米曲霉制成孢子悬浮液，按一定量(1 mL菌悬液/10 g固体培养基)接入种曲三角瓶培养基中培养，30℃生化培养箱静置培养48 h，其间手动摇瓶2次。

1.3.4 米曲霉3042固态发酵鱿鱼废弃物

米曲霉3042固态发酵鱿鱼废弃物的工艺流程见图1。主要控制点:分装100 mL浆液于500 mL三角瓶中;105℃湿热灭菌40 min;30℃摇床静置发酵(每隔12 h摇瓶翻曲)。

图1 米曲霉固态发酵鱿鱼废弃物工艺流程

1.4 分析方法

蛋白酶酶活力的测定:福林酚法[3］;氨基态氮:甲醛滴定法(GB 5009.39-851996);挥发性盐基氮(TVB-N):半微量扩散法[4］;总酸含量的测定:电位滴定法(GB/T 12456-901991);总可溶性氮(TSN)含量测定:凯氏定氮法[5］;TCA可溶性氮(TCA-N)含量测定;游离脂肪酸含量以及酸价的测定:KOH标准滴定液滴定法[7］;pH值测定:酸度计;脂肪氧化丙二醛含量(TBARS值)的测定:见文献[8］。

2 结果与讨论

2.1 加盐量对米曲霉固态发酵鱿鱼废弃物理化指标的影响

2.1.1 对发酵过程中蛋白酶活力的影响

米曲霉固态发酵鱿鱼废弃物的过程中主要产生氨基酸和短肽，其中有一部分是呈味氨基酸，使得发酵液具有独特的风味。而这些氨基酸和短肽的产生则主要由于种曲和发酵过程中米曲霉产生的蛋白酶水解鱿鱼废弃物蛋白质所得，但是食盐却对蛋白酶酶活力的大小具有显著的影响作用[9］。食盐对酶活力的影响通常因酶种类及食盐浓度不同而有差异，一般情况下，高盐会明显抑制蛋白酶活力。

在食品工业生产中，中性蛋白酶很重要，因为中性蛋白酶能将蛋白质水解成氨基酸、多肽等，并可减少蛋白水解苦味物质产生[10］。鉴于发酵初始环境pH值是弱酸性，并且整个发酵过程中的pH值基本都在弱酸性的条件下，所以同时研究了发酵过程中酸性蛋白酶的活力变化。

图2、图3、图4揭示了发酵过程中蛋白酶酶活力的变化趋势，可以看出:(1)在不同的加盐量下初始的酶活力不相同，随着盐浓度的升高，蛋白酶酶活力明显降低，这与Sappasith Klomklao等[11］的研究现象相同，加盐量16g/100g(原料)的各种酶的酶活力明显受到了抑制，这可能是因为高盐作用下，NaCl的高渗透压作用使蛋白酶分子的结构不稳定，降低蛋白酶的生理活性，使酶活下降;另外，也可能是因为蛋白酶发生盐析变性，降低了酶活[12-13］。(2)在不同的加盐量下，随着发酵时间的增加，各种酶的酶活力都是逐渐升高的，发酵到第6天后各种酶的酶活力增加变缓逐渐趋于平稳，有的甚至开始下降，这可能是蛋白酶的自溶分解以及代谢产物氨基酸、多肽等的抑制作用[14］所致。

2.1.2 对发酵过程中氨基氮、TCA-N、TSN的影响

发酵过程中产生的氨基酸和短肽主要是微生物源蛋白酶水解作用的效果，这是由于发酵之前的灭菌过程已经使内源性蛋白酶失活。因此发酵过程中产生的氨基氮含量的高低是评价发酵质量的重要指标，可以用于表征蛋白质的水解程度[15-17］。TCA-N含量变化是衡量生物活性肽含量的重要指标，这对研究鱿鱼内脏中生物活性物质具有重要的意义;TSN同样是衡量发酵过程氮含量变化的重要指标，结合氨基氮含量用来表征蛋白质的变化。因此考察了发酵过程中氨基氮、TCA-N、TSN的变化情况。

图2 加盐量对发酵过程中酸性蛋白酶的影响

图3 加盐量对发酵过程中中性蛋白酶的影响

图4 加盐量对发酵过程中碱性蛋白酶的影响

图5 加盐量对发酵过程中氨基氮含量的影响

图6 加盐量对发酵过程中TCA-N含量的影响

图7 加盐量对发酵过程中TSN含量的影响

从图5-图7可见，不同加盐量下氨基氮，TCAN，TSN随时间的变化趋势与蛋白酶酶活力的变化规律基本一致，都在第6天后开始变化缓慢。4、8、12、16 g/100 g(原料)的加盐量下发酵液中氨基态氮含量第10天分别达到0.725、0.671、0.626 g/100 mL 和0.502 g/100 mL。其氨基态氮含量随加盐量的递增呈递减趋势，可能是因为高盐使蛋白质脱水并中和其电荷，而从溶液中沉淀出来，使蛋白质凝聚变性，降低了酶活，从而降低水解率，导致水解度降低，氨基酸含量减少[18］;另一方面，最终产物如氨基酸、多肽的存在也抑制了一部分酶活，从而降低了水解度[14］;同时高盐对于发酵液中的蛋白质也有类似作用，使蛋白质发生盐析变性，沉淀出来，使蛋白质含量下降，导致水解得到的氨基态氮也减少。

不同加盐量下TCA-N和TSN的初始含量不同，这是由于在不同的盐浓度下它们的溶解度不同导致初始含量不同。但它们的总体变化趋势与氨基氮的变化趋势相同，这可能是由于原料蛋白质不断被蛋白酶水解变成可溶性的肽类及氨基酸成分，其实主要源于较高的蛋白酶活力以及均质加工增加了酶作用面积[19］。TSN包括氨基氮和一些可溶性的蛋白氮，由图6，图7我们发现12g/100g(原料)的加盐量下，在发酵的第4天其TSN和TCA-N含量超越了其他3种加盐量的发酵工艺，这可能与发酵环境的离子强度有关系，使得12g/100g(原料)的TSN和TCA-N的含量增加[20］。

2.1.3 对发酵过程中总酸含量和pH值的影响

由图8可以看出整个发酵过程中pH值的变化不甚明显，高盐浓度的pH值低于低盐浓度的pH值。这也与蛋白酶活力大小以及氨基氮的溶出率有关。有机酸是发酵液的主要风味物质，发酵过程中总酸含量的变化反映产酸微生物的变化情况，是发酵过程控制的要素之一。由图9可知，各加盐量处理下的总酸变化随着时间的延长呈现先增后降的钟形变化趋势，发酵10 d后8 g/100 g(原料)加盐量下的总酸含量最低，12 g/100 g原料加盐量下的总酸最高。8 g/100 g(原料)盐度下发酵液最后的pH值为5.77，12 g/100 g(原料)盐度下的pH值为5.10。表明发酵前期，微生物生长产酸、产酶，pH值降低，酸度增加，后期随着酶的水解，氨基酸增加，pH值增加，酸度降低。特别是低盐下，腐败菌产生挥发性氨类物质，使得酸度急剧下降。综上总酸呈现这种变化趋势可能是发酵过程中微生物产酸量和产生的碱性挥发性盐基氮成分相互作用的结果[9］。

图8 加盐量对发酵过程中pH值的影响

图9 加盐量对发酵过程中总酸含量的影响

2.1.4 对发酵过程腐败情况的影响

在鱿鱼废弃物发酵过程中加盐是为了抑制腐败菌的生长，防止发酵液腐败变质。低盐会使腐败菌生长，产生各种挥发性氨类等物质影响发酵产品品质;高盐虽可抑制腐败菌生长，但同时会抑制米曲霉的生长，延长发酵时间。在食品加工业中，通常采用TVBN值来检测水产品的腐败程度[21］。

由图10知，整个发酵过程中，TVB-N的含量呈上升趋势，4、8 g/100 g(原料)的加盐浓度下，发酵后期的增加速度逐渐加快，4 g/100 g(原料)下表现最为明显。12、16 g/100 g(原料)的加盐量下发酵后期，TVB-N含量趋于平稳。发酵10 d后，4、8、12、16 g/100 g(原料)的加盐量下 T VB-N值分别为223.0，162.1，122.6，98.1 mg/100 mL。4 g/100 g(原料)加盐量下的TVB-N值比其他3个加盐量下的值明显高出很多，这可能与体系中的水分活度有关，一般细菌的生长最低aW为9.4，所以在高盐浓度下发酵液中腐败细菌被抑制，从而降低了挥发性盐基氮的产生[22］。4 g/100 g(原料)的加盐量下发酵结束时发酵液的感观评定表明它的风味明显逊于其他3种加盐量下的产物风味，所以在后续的发酵中建议不选择此加盐量。

图10 加盐量对发酵过程中挥发性盐基氮含量的影响

2.1.4 对发酵过程中脂肪的影响

鱼类的脂肪中富含大量的不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸极易被氧化产生哈喇味，除此之外还会影响到质构、色泽和营养价值[23］。经检测鱿鱼废弃物中的脂肪含量为1.7%左右，所以考察发酵过程中脂肪氧化的变化显得颇为重要。

图11 加盐量对脂肪的TBARS值的影响

脂肪氧化的终产物之一为丙二醛，丙二醛与硫代巴比妥酸(TBA)在一定条件下反应产生红色物质(TBARS)，并在532 nm下有最大吸收峰，因此TBARS值的大小可用来表示脂肪受氧化的程度[24］。目前的科学研究中，也多用TBARS值来表征脂肪的氧化程度，因此实验考察了TBARS值的变化趋势。

由图11可以看出，鱿鱼加工废弃物在发酵过程中TBARS值的变化趋势:①高盐浓度下TBARS值在第2～4天有个明显的下降趋势，低盐浓度下，在第4～6天有明显的下降趋势，这可能与不同盐浓度下蛋白质的溶出程度有关，因为丙二醛可以与蛋白质发生交联反应，使丙二醛呈结合状态而不被检测出来;②在整个发酵过程中，高盐浓度下，TBARS值呈现明显的上升趋势，低盐浓度下，TBARS值变化缓慢，发酵后期趋于平稳。Sikorski等研究表明，鱼类保持高品质所允许的TBARS值的最大值为5 mg/kg即5 μg/g[25］。发酵结束后，4、8、12、16 g/100g(原料)的加盐量下 的TBARS值分别 为4.723、4.375、7.317和7.8855μg/g，高盐浓度下发酵结束时的TBARS值超过了人的感官所能承受的范围，所以建议发酵生产中不选择此发酵条件。

图12 加盐量对游离脂肪酸含量的影响

图13 加盐量对酸价的影响

由图12，图13可以看出发酵过程中的游离脂肪酸含量和酸价的变化趋势:(1)均保持上升趋势，这与Tatterson和Windsord的研究结果相同[26］，这可能是因为脂肪在酶的作用下水解出脂肪酸以及脂肪氧化过程中产生了一些低分子的脂肪酸;(2)发酵后期它们的上升趋势变得明显，这说明游离脂肪酸在不断的积累，酸价的变化趋势也反映出了鱿鱼废弃物的发酵过程渐近完全。

综上实验结果表明，8 g/100 g(原料)盐度下的氨基氮较高，而TVB-N较低，TBARS值较低，所以确定8 g/100 g(原料)盐度为最适宜的发酵的加盐量。

2.2 发酵动力学研究

为了揭示发酵过程的基本特征，预测发酵液中氨基酸含量，判知蛋白质的水解程度，从而判断发酵过程的完全与否，在确定加盐量的基础上，依据图5米曲霉发酵产氨基氮曲线，采用Oringin7.5软件对米曲霉的氨基酸生成进行非线性曲线拟合。依据发酵特点采用曲线估计模型对氨基酸生成进行多项式拟合，拟合曲线如图14所示。

图14 不同NaCl添加量下的二项式拟合氨基酸生成量

表1 不同盐度氨基酸生成模型参数

表1可以看出不同加盐量下的拟合方程R2＞0.970，P＜0.05影响显著，拟合程度高。适应4～16 g/100 g(原料)的加盐范围内的动力学模型如下:

假设动力学方程为Y=AT2+BT+C(Y:氨基氮浓度，A、B、C:模型参数，T:发酵时间)则A，B，C对加盐量x(4～16g/100g(原料))的多项式拟合方程为[27-28］:

由方程知，A，B，C对加盐量x的拟合方程R2＞0.9980，拟合精度高。

综上发酵温度控制30℃，不添加任何外源性蛋白酶，加盐量在4～16 g/100 g(原料)的区间内，氨基氮含量对发酵时间的拟合方程能够很好的反映发酵过程的变化，从而指导实际的企业生产。

3 结论

本实验采用控温、加曲，低盐杀菌等发酵方法进行鱿鱼废弃物的固态发酵。综合考虑发酵过程中蛋白酶活、氨基酸态氮、总酸、TVB-N等指标，发现8 g/100 g(原料)盐度下氨基氮较高，TVB-N值较低，TBARS较低，确定8 g/100 g(原料)盐度为最适宜的发酵的加盐量。同时用ORIGIN7.5软件对实验数据进行处理计算，得到了氨基酸生成动力学模型，在一定程度上揭示了发酵的基本特征，可以用来预测发酵液中氨基酸浓度，判断发酵过程的正常与否，从而对发酵操作参数提出要求，以便加以控制，指导实际生产，实现发酵过程的优化，为今后的工业化生产提供依据。

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ABSTRACTThe study used solid-state fermentation technology with controlled temperature，koji，and low-salt sterilization to re-process squid wastes in order to reduce environmental pollution and use protein resources effectively.During the solid-state fermentation，protease activity，amino nitrogen content，total acid content，volatile basic nitrogen(TVB-N)content and so on were determined，to study the optimal fermentation process.The result shows that adding the amino nitrogen to 8g/100g raw material was the optimal fermentation process，and the TCA soluble nitrogen(TCA-N)，total soluble nitrogen(TSN)were higher，while TVB-N content and malondialdehyde content(TBARS values)were lower.We also used ORIGIN7.5 software to calculate the experimental data and obtained the dynamics model of producing amino acid nitrogen.

Key wordsaspergillus oryzae，salinity，squid wastes，solid-state fermentation

Study Salinity on Solid-state Fermentation of Squid Wastes and Its Kinetics

Zhang Jian-you，Jiang Yan-xi，Ding Yu-ting
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University ofTechnology，Hangzhou 310014，China)

博士研究生(丁玉庭教授为通讯作者)。

*浙江省科技厅科研社会发展项目“鱿鱼加工副产物的高值化开发利用与产业化”(2008C23021)

2010-01-21，改回日期:2010-03-29