平菇产木聚糖酶固态发酵条件优化和酶学性质研究

吴 萍，周鸣鸣，盛 伟

（1.安徽科技学院生命科学学院，安徽凤阳233100；2.南通大学生命科学学院，江苏南通226007）

平菇产木聚糖酶固态发酵条件优化和酶学性质研究

吴 萍1，周鸣鸣2，盛 伟1

（1.安徽科技学院生命科学学院，安徽凤阳233100；2.南通大学生命科学学院，江苏南通226007）

利用平菇（Pleurotus ostreatus）降解甘蔗渣固态发酵生产木聚糖酶，通过单因素和正交实验确定最佳培养基组分及其配比，并对其粗酶的酶学性质进行了研究。结果表明：碳源为甘蔗渣8g∶玉米芯2g，氮源为2.0%酵母膏，pH为4，料水比为1∶3.2，装瓶量为5g/125mL三角瓶，培养10d时，得到的酶活力最高，产酶量可达2918.95 U/g。粗酶液的最适反应pH为5，最适反应温度为40℃，在pH4～6的范围内酶活性较稳定。温度的适应性较宽，在30～70℃的范围里，相对酶活仍保持在65%以上。

木聚糖酶，固态发酵，平菇，甘蔗渣

Abstract：The Pleurotus ostreatus was used to degrade bagasse for producing xylanase through solid-state fermentation.The optimum medium components and their ratio were determined by single factor and orthogonal tests and the crude enzyme properties was also studied.The results showed that carbon source included bagasse（8g）and corncob（2g），nitrogen source was 2.0%yeast extract，pH scale 4，feed water ratio 1∶3.2，bottling capacity 5g/125mL flask，for 10d culture.Under this condition，enzyme activity was the highest and its yields reach 2918.95U/g.The optimal reaction pH value was 5 for crude enzyme solution，the optimum reaction temperature 40℃，and the enzyme activity was more stable during the range of pH4～6.The temperature adaptability was wide and the relative enzyme activity remained over 65%in the range of 30～70℃.

Key words：xylanase；solid-state fermentation；Pleurotus ostreatus；bagasse

甘蔗渣作为一类大量存在的天然纤维质和可再生利用的重要资源，受到越来越广泛的重视。甘蔗渣中约含有30%的半纤维素，微生物产生的纤维素酶可以将其降解为单糖及少量寡糖［1］。木聚糖是半纤维素的一种重要组成成分，广泛存在于各种植物资源中［2］。木聚糖酶是木聚糖的水解酶，它不仅在饲料、造纸、纺织、医药及能源等领域有着广阔的应用前景，而且在食品工业中也有很大的应用价值。作为一种食品添加剂具有显著的优越性：首先，木聚糖酶本身是一种蛋白质，既无毒又无害；其次，酶都具有高度的专一性和高效性，即使用目的性强且经济合算；而且木聚糖酶的酶促反应条件温和，从而可以有效地避免在食品加工中对营养成分带来的损失［3-6］。本实验试图探讨以廉价的甘蔗渣作为主要原料，添加其他辅料，利用安全且有很高营养价值的食用真菌—平菇进行固态发酵生产木聚糖酶，并对其固态发酵条件和酶学性质进行了初步的探讨。

1 材料与和方法

1.1 材料与仪器

平菇（Pleurotus ostreatus） 由安徽科技学院生物技术实验中心提供；甘蔗渣 市场购入的新鲜甘蔗，去汁后，甘蔗渣置60℃烘箱内烘干，用万能粉碎机粉碎备用；3，5-二硝基水杨酸 中国医药集团上海试剂公司；燕麦木聚糖 Sigma公司；斜面培养基 马铃薯 200g，蛋白胨 20g，葡萄糖 20g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB1两粒，琼脂 18～20g，水1000mL，pH自然，在121℃下灭菌30min；液体种子培养基 马铃薯200g，葡萄糖20g，甘蔗渣2g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1000mL，pH自然，在121℃下灭菌30min；基础发酵培养基 甘蔗渣 8g：麸皮 2g，硫酸铵 0.1g，KH2PO40.05g，MgSO40.05g，水30mL，pH 自然，在121℃下灭菌30min。

7230G可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；立式圆形压力蒸汽灭菌器 上海医用核子仪器厂；GL-20B高速离心机 上海安亭科学仪器厂；恒温水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；SW-CJ超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；微型粉碎机 天津泰斯特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵过程

1.2.1.1 斜面菌种活化 将平菇菌种用无菌接种铲铲下2～3块菌丝，接种于斜面培养基上，然后在25℃恒温箱内培养5～7d。

1.2.1.2 液体种子的制备 将已活化的平菇菌种在无菌条件下，用事先准备好的无菌液体培养基分别洗下菌丝，将其倒入盛有80mL液体种子培养基的250mL三角烧瓶中，然后用八层纱布封口后，放入摇床内，25℃，160r/min 培养5d。

1.2.1.3 固态发酵培养 将培养好的种子液按20%的接种量接入装有5g固体基础发酵培养基的125mL的三角瓶中，然后放入培养箱内，25℃培养10d。

1.2.2 不同发酵条件对产酶影响的实验设计

1.2.2.1 碳源不同组分比的影响（g） 甘蔗渣10，甘蔗渣8∶玉米芯2，甘蔗渣6∶玉米芯2∶麸皮2。

1.2.2.2 不同氮源的影响（添加量均为培养基干料比的1%） 考察硝酸铵、酵母膏、牛肉膏、黄豆粉、玉米粉的影响。

1.2.2.3 不同起始 pH的影响 pH分别为4、5、6、7、8。

1.2.2.4 不同料水比的影响 1∶2.8、1∶3.2、1∶3.6、1∶4、1∶4.4。

1.2.2.5 不同装料量的影响 在125mL的三角瓶中分别装入培养基 3、5、7、9、11g。

1.2.2.6 不同培养天数的影响 7、8、9、10、11、12d。

1.2.3 产酶因素的正交实验设计 在单因素实验的基础上，采用L16（45）正交实验对碳源、氮源、pH、料水比以及培养天数这5个产酶的因素进行优化，因素水平表见表1。

表1 因素水平表

1.2.4 粗酶液制备及酶活测定

1.2.4.1 粗酶液制备 在固态发酵好的培养物中加入50mL 0.2mol/L pH4.8醋酸缓冲液，于40℃浸泡2h，过滤，再取滤液置于5mL离心管中，6000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

1.2.4.2 木聚糖酶活力测定（采用DNS法测定）［7-9］

取0.1mL上清液于15mL干燥刻度试管中，加入1.9mL 1%木聚糖溶液（pH4.8磷酸缓冲液配制），40℃水浴30min后，加入DNS试剂3.0mL。沸水浴5min，终止反应并显色。冷却定容至15mL，摇匀。于520nm波长下测定吸光度，以100℃灭活粗酶液作对照。

酶活力单位定义为：在40℃每分钟水解木聚糖形成相当于1!g还原糖（以木糖计）所需的酶量（U/g），即：

木聚糖酶活力单位=NG/0.1×30

其中：N-酶液稀释倍数；G-酶解溶液中木糖的含量，!g；0.1-加酶量；30-酶解时间，min。

1.2.5 木聚糖酶酶学性质的研究

1.2.5.1 木聚糖酶的最适pH 分别用pH3～8缓冲液配制的木聚糖溶液作为底物，加入0.1mL的酶液，然后在最适反应温度40℃下水浴30min后，加入DNS试剂3.0mL。沸水浴5min，终止反应并显色。冷却定容至15mL，摇匀。空白对照中稀释酶液在沸水浴中水浴15min使其失活，其它条件不变，测定其吸光度，计算其残余木聚糖酶活力。

1.2.5.2 木聚糖酶的最适温度 取0.1mL的酶液于15mL干燥刻度试管中，加入1.9mL 1%燕麦木聚糖溶液（pH4.8磷酸缓冲液配制），分别在30～80℃的水浴条件下反应30min后，加入DNS试剂3.0mL。沸水浴5min，终止反应并显色。冷却定容至15mL，摇匀。空白对照中稀释酶液在沸水浴中水浴15min使失活，其它条件不变，测定其吸光度，计算其残余木聚糖酶活力。

1.2.5.3 木聚糖酶的pH稳定性 用pH3～8的缓冲液稀释酶液，在40℃水浴中保温4h，然后分别取0.1mL稀释过的酶液，并加入1.9mL 0.2mol/L用最佳反应pH缓冲液配制的1%（W/V）木聚糖溶液，然后在最佳反应温度下水浴，酶解30min，加3mL DNS，沸水浴反应5min，冷却，定容至15mL混匀，于520nm处测其吸光度，未经处理的酶定为100。测定其吸光度，计算其残余木聚糖酶酶活力。

1.2.5.4 木聚糖酶的热稳定性 将粗酶液分别在30～80℃水浴中保温1h，冷却后，取0.1mL粗酶液加入1.9mL 0.2mol/L pH4.8醋酸缓冲液配制的1%木聚糖溶液，在最佳反应温度下水浴，酶解30min，加3mL DNS，沸水浴反应5min，冷却，定容至15mL混匀，于520nm处测其吸光度，未经处理的酶定为100，计算其残余木聚糖酶酶活力。

2 结果与分析

2.1 固体发酵结果分析

2.1.1 碳源不同配比对产木聚糖酶的影响 在原料的选择上，本着经济、易得的原则，选用了甘蔗渣作为主要原料，并对甘蔗渣的配比进行产酶实验，结果见图1。

图1 碳源不同配比对产木聚糖酶的影响

由图1可知，以甘蔗渣8g∶玉米芯2g的产酶水平最高，甘蔗渣6g∶玉米芯2g∶麸皮2g次之。很明显单独以甘蔗渣作为碳源的产酶活力没有复合碳源好，但是甘蔗渣6g∶玉米芯2g∶麸皮2g产酶活力又没有甘蔗渣8g∶玉米芯2g高，这可能是由于麸皮的加入，导致固体培养基的粘性程度变大，通透性降低，从而影响了菌株生长，所以酶活力以甘蔗渣8g∶玉米芯2g最佳。

2.1.2 不同氮源对产木聚糖酶的影响 在氮源的选择上，分别以硝酸铵、酵母膏、牛肉膏、黄豆粉、玉米粉作为氮源来测定对产酶的影响，结果见图2。

图2 不同氮源对产木聚糖酶的影响

由图2可知，几种氮源对菌株产酶的影响不大，只是酵母膏略高于其它几种氮源。从生产成本考虑，可选用黄豆粉或玉米粉作为氮源比较经济。

2.1.3 不同pH对产木聚糖酶的影响 pH对调节菌丝细胞内酸碱平衡和分解培养料的营养物质具有一定作用。配制不同初始pH，以研究固体培养基的初始pH对木聚糖酶活力的影响，结果见图3。

图3 不同pH对产木聚糖酶的影响

由图3可知，以pH为5时所产酶的活力最高，偏酸或偏碱都对酶活力的提高产生影响。这是因为pH不仅会影响到菌株细胞膜所带的电荷，从而引起细胞对营养物质的吸收，而且还可以通过改变培养基中有机化合物的离子化作用程度，对细胞施加间接影响，改变某些化合物分子进入细胞的状况，从而促进或抑制微生物的生长。

2.1.4 不同料水比对产木聚糖酶的影响 不同的料水比对产酶影响较大，因此对基础固体培养基进行加水比例实验，结果见图4。

图4 不同料水比对产木聚糖酶的影响

由图4可知，料水比为1∶3.2时所产酶活最高。如果水分太少培养基比较干燥，菌体的生长和酶活力提高均受到影响；如果水分过大，则供氧和散热条件恶化，菌体生长缓慢，酶活力也不高。

2.1.5 不同装料量对产木聚糖酶的影响 分别向125mL的三角烧瓶中装入基础发酵培养基3、5、7、9、11g，于25℃恒温培养箱中培养10d，测定发酵产物的酶活力，结果见图5。

图5 不同装瓶量对产木聚糖酶的影响

装料量对产酶的影响主要表现在：装料量过多，通风不畅，供氧不足，微生物生长不好而影响产酶；装料量过少，则基质表面水分蒸发过快，影响微生物的生长和代谢，产酶量仍然不高。由图5可知，装瓶量为5g时，产酶活力达到最高，所以选择装料量为5g为宜。

2.1.6 不同培养天数对产木聚糖酶的影响 在基础培养基中定量接入菌种，从培养7d开始测定酶活力，每天测定一次，结果见图6。

图6 不同培养天数对产木聚糖酶的影响

由图6可知，固态发酵时间采用8d最好，其后依次减小。因为在培养初期，由于营养条件较好，菌丝生长旺盛，8d后酶活达到最大值。此后，随着生长时间的延长，菌丝体逐渐老化，酶活力也逐渐呈下降趋势。

2.2 产酶条件的正交优化

产酶条件的正交实验结果见表2。结果表明：16个处理中，产酶量各不相同，存在一定的差异。决定产酶量大小的影响因子依次是C＞A＞B＞D＞E；产酶条件的最优因子组合为A1B4C1D2E4，即培养基中碳源为甘蔗渣8g∶玉米芯2g，氮源为2%酵母膏，pH为4，料水比为1∶3.2，最佳培养时间为10d。在此培养条件下得到的酶活力最高，产量可达2918.95U/g。

表2 正交实验结果

2.3 木聚糖酶部分酶学性质的研究

2.3.1 木聚糖酶的最适pH 按1.2.5.1方法进行实验，结果见图7。

图7 pH对酶活力的影响

由图7可知，该酶的最适反应pH为5。偏酸偏碱时，酶的活性均有所减小。

2.3.2 木聚糖酶的最适温度 按1.2.5.2方法进行实验，结果见图8。

图8 温度对酶活力的影响

由图8可知，酶的最适反应温度为40℃，超过60℃以上时，酶的活力逐渐开始下降。

2.3.3 木聚糖酶的pH稳定性 按1.2.5.3方法进行实验，结果见图9。

由图9可知，该木聚糖酶在pH为5时酶的相对活力达到了100%，在pH4～6的范围内酶活性较稳定。而且在pH4～8范围内酶活仍保留了50%以上，这可能与平菇合成的木聚糖酶系组成有关，表明该酶系中可能有多种组分存在，因此该酶具有一定的耐酸和耐碱能力。

图9 木聚糖酶的pH稳定性

2.3.4 木聚糖酶的热稳定性 按1.2.5.4方法进行实验，结果见图10。

图10 木聚糖酶的热稳定性

由图10可知，木聚糖酶在40℃时酶的相对活力是100%，而且在30～60℃的范围内，相对酶活仍保持在80%以上。因此，平菇木聚糖酶具有广泛的耐热能力，从而它的应用范围也更为广泛。

3 结论

实验结果表明，以甘蔗渣为主要原料，平菇产木聚糖酶的最佳固态发酵条件碳源为甘蔗渣8g∶玉米芯2g，氮源为2%酵母膏，pH 为4，料水比为1∶3.2，装瓶量为5g/125mL三角瓶，最佳培养时间为10d，在此培养条件下得到的酶活力最高，产量可达2918.95U/g。

平菇产木聚糖酶的最适反应pH为5，在pH4～8的范围里该酶的活性变化不大，因此具有一定的耐酸和耐碱的能力；而最适温度为40℃，温度的适应性较宽，在30～70℃的范围里，相对酶活仍保持在65%以上。

4 讨论

本实验选用食用真菌——平菇在优化条件下固态发酵甘蔗渣生产木聚糖酶其意义有两个方面：一是用廉价的甘蔗渣作为主要原料，通过固态发酵，生产木聚糖酶，具有生产成本低、经济效益高和生产工艺简单等特点；二是选择食用真菌——平菇作为始菌，主要考虑到：人类长期具有饮食食用菌的习惯，用该菌株产生的木聚糖酶在食品工业上应用非常安全；由于食用菌是腐生菌，它能够利用各种废弃物转化为真菌生物体；食用菌能分泌水解性的胞外酶，将纤维素、半纤维素（木聚糖）等大分子物质分解而利用［10］；国内外报道产木聚糖酶的微生物大多是细菌、霉菌等，很少有利用平菇这种食用真菌作为产木聚糖酶菌株的来源进行研究的，因此采用平菇为初始菌来发酵甘蔗渣生产木聚糖酶在食品工业的应用具有很好的前景。

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Study on enzymatic characteristics and solid-phase fermentation condition of xylanase from P/eurotus ostreatus

WU Ping1，ZHOU Ming-ming2，SHENG Wei1
（1.College of Life Science，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China；2.College of Life Science，Nantong University，Nantong 226007，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0168-05

2009-09-16

吴萍（1958-），女，副教授，主要从事微生物学教学与微生物发酵方面的研究。

安徽省教育厅自然科学基金资助（KJ2009B168Z）；安徽科技学院生物学重点建设学科项目资助（AKXK20102-1）。