饥饿胁迫对克氏原螯虾消化器官组织结构的影响

魏克强,赵婷,王建军,宋欣

(1.山西大学 生命科学学院,山西太原 030006;2.太原铁路局 太原供电段,山西太原 030013;3.河北保定师范专科学校涿州分校,河北涿州072750)

在自然条件下,由于食物分布在时空上的不均匀性、季节更替或环境剧变等原因,即使在饲养条件下,由于食物供给不足,动物在其生命周期中经常会面临食物资源的短缺而遭受饥饿胁迫。当胁迫条件改善或消失,一些动物呈现出补偿生长(compensatory growth)的现象。研究表明,饥饿胁迫对鱼类的生存发育、生化组成、繁殖习性和消化系统的组织结构均有显著的影响[1～8],Bisbal和Bengtson等认为:研究饥饿状态下消化系统的组织学变化,对评价鱼类的营养状况具有重要的意义[8]。迄今,有关虾类饥饿与补偿生长方面的研究还比较少,仅发现饥饿胁迫对斑节对虾(Penaeus monodon)、锯额长臂虾(Palaemon serratus)的消化腺组织结构会产生显著的影响[9～10],克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、中国对虾(Penaeus chinensis)、南美白对虾(Penaeus vannamei)和日本沼虾(Macrobrachium nipponense)[11～14]等少数虾类具有补偿生长效应。

克氏原螯虾Procambarus clarkii(Girard)隶属甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),螯虾科(Cambaridae),是一种适应性强、分布广、生长快、繁殖率高、食性杂的淡水虾类,不仅是淡水渔业资源的重要组成部分,而且还被用作环境科学、营养学、药理学研究的模式动物[15]。在克氏原螯虾的消化系统中,胃起碎化与过滤食物的作用,中肠负责消化与吸收。肝胰腺是重要的消化腺,上皮细胞可分为分泌细胞(B细胞)、吸收细胞(R细胞)、纤维细胞(F细胞)和胚胎细胞(E细胞)4种,其中,R细胞中有与物质的合成与储存功能相适应的结构,如脂肪滴、液泡等,F细胞有发达的粗面内质网,胞质中含大量的分泌颗粒,主要功能是合成各种消化酶,B细胞中有大液泡、丰富的粗面内质网和游离核糖体,主要是起分泌作用[16,17]。

本文以克氏原螯虾的胃、中肠和肝胰腺为研究对象,研究其在饥饿胁迫下组织结构的变化,旨在为虾类的营养研究以及养殖实践提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

克氏原螯虾购自太原市某农贸市场,健康活泼、体形正常,体长约3 cm,体重为(4.65±0.17)g。

1.2 方法

1.2.1 饲养条件

实验开始前一周暂养于玻璃水族箱(100 cm×50 cm×55 cm,实际水量40 L)内进行驯养,每箱10尾,每日定时充足投喂人工配合微颗粒饲料5次,残饵于下次投喂前收集,粪便及时用吸管取出。水族箱为循环水系统,并配以充气泵连续充气,水温控制在(25.0±1.0)℃范围(室温由空调调节)。

1.2.2 试验设计

试验设计参考文献[1,11]的方法。实验分为饥饿组和对照组,每组30尾,每箱10尾。对照组按1.2.1的方法充足投食,实验组饥饿20 d。为防止饥饿时螯虾相互残杀,饥饿组在实验阶段用带孔(直径为0.5 cm)的半透明塑料板将水族箱分隔成10室,每室放1尾虾,饥饿结束时拆除塑料隔板。

1.2.3 样品处理

在实验结束时,从各箱分别随机取4尾虾的胃、中肠和肝胰腺,部分样品Davidson's AFA液固定24 h,70%酒精冲洗并保存,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚度 5～6μm,在 Leica Qwin图像分析仪上观察并拍照。另一部分样品迅速切成1 mm3小块,2.5%冷戊二醛和1%锇酸双重固定,0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗三次,每次约15 min,系列乙醇梯度脱水。扫描电镜材料脱水后移入醋酸异戊酯置换,临界点干燥,渡膜,于XL30ESEM扫描电镜观察并拍照。透射电镜样品脱水后环氧树脂包埋,超薄切片,以醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,在JEM-1200EX型透射电镜下观察并拍照。

2 结果与分析

胃、中肠和肝胰腺是克氏原螯虾的主要消化器官,对照组的观察结果显示,螯虾的胃上皮为单层柱状上皮,上皮下为疏松结缔组织,胃上皮下无任何腺体(图版Ⅰ,图1～3);中肠肠壁自内向外分为几丁质层、上皮层、结缔组织层、肌层和外膜层,肠壁向肠腔内突出形成纵褶,每条纵褶的上皮又形成许多小的皱褶,皱褶上有密集的微绒毛(图版Ⅰ,图4、图5;图版Ⅱ,图1);肝胰腺肝盲管管壁由肝细胞和分泌细胞构成,肝细胞长形,内含食物泡或呈空泡状,分泌细胞梭形,夹杂于肝细胞之间(图版Ⅰ,图 6 、图 7;图版Ⅱ ,图 2)。

饥饿20 d后,实验螯虾均存活,胃、中肠和肝胰腺的一般组织学结构未遭到严重破坏。观察结果显示:与对照组比较,饥饿组螯虾的胃壁变薄,结缔组织膜间间隙增大,呈疏松状(图版Ⅰ,图8);中肠管腔变窄,肠壁变薄,呈透明状,单层柱状上皮细胞分界模糊,皱褶变得少而浅,微绒毛减少(图版Ⅰ ,图9、图 10;图版 Ⅱ,图 3);肝胰腺萎缩,呈褐色,肝细胞内脂滴减少,细胞间隙增大(图版Ⅰ,图11、图12),肝盲管分泌物减少(图版Ⅱ,图4);饥饿螯虾的胃上皮细胞(图版Ⅱ,图 5、图 6)、肠上皮细胞(图版Ⅱ,图 7)尤其是肝细胞(图版 Ⅱ,图8、图9)中有一部分线粒体的嵴开始消失,呈模糊状且排列不整齐;一部分线粒体开始空泡化,基质的电子密度降低;一部分线粒体内室肿胀,嵴大部分消失;部分肝胰腺细胞萎缩,细胞核变形(图版Ⅱ,图10),粗面内质网肿胀、糖原颗粒减少(图版Ⅱ,图11、图12),R细胞中丰富的脂肪滴大量减少(图版Ⅱ ,图13～15)。

3 讨论

研究发现,饥饿胁迫下仔、稚鱼的组织结构主要呈现肠道组织粘膜层上皮细胞高度显著下降,刷状缘萎缩甚至消失,微绒毛断裂,线粒体肿胀、嵴断裂等特征[1～4,7,8,18]。研究还表明,虾类对饥饿反应最为敏感的是R细胞,R细胞的形态结构可以作为评判甲壳动物饵料营养价值的检测指标[9,10,19];饥饿状态可导致斑节对虾(Penaeus monodon)幼虾消化腺细胞萎缩,微绒毛变短,内质网数量减少,线粒体膨大;还使锯额长臂虾(Palaemon serratus)肝胰腺R细胞和F细胞粗面内质网的嵴变短,线粒体膨大、数量减少。本实验与上述研究结果相一致,饥饿胁迫对克氏原螯虾肝胰腺组织R细胞的影响最为显著,其次是中肠组织和胃组织的上皮细胞。

4 结论

通过组织学观察的方法研究了饥饿胁迫对克氏原螯虾消化器官组织结构的影响,结果发现:螯虾胃壁变薄,中肠管腔变窄,肝胰腺萎缩,分泌物减少;中肠肠壁皱褶变得少而浅,微绒毛减少;肝细胞中脂肪滴大量减少,细胞间隙增大;胃、肠上皮细胞尤其是肝细胞内线粒体肿胀、嵴断裂、空泡化,粗面内质网肿胀、糖原颗粒减少。这说明在饥饿胁迫下,螯虾消化器官的组织学结构与功能都会明显衰退。

图版ⅠPlateⅠ图1.对照组贲门胃横切(x 50);图2.对照组幽门胃纵切(x 50);图3.对照组胃结缔组织(x100);图4.对照组中肠纵切(x 50);图5.对照组中肠皱壁(x 200);图6.对照组肝胰腺横切(x100);图7.对照组肝胰腺细胞(x200);图8.饥饿组胃结缔组织(x100);图9.饥饿组中肠纵切(x 50);图10.饥饿组中肠皱壁(x 200);图11.饥饿组肝胰腺横切(x100);图12.饥饿组肝胰腺细胞(x200).图中:CT结缔组织;MF皱壁;HC肝细胞Fig.1 Transverse section of the cardiac stomach in control group.x 50;Fig.2 Longitudinal section of thephloric stomach in control group.x 50;Fig.3 Connective tissue of the stomach in control group.x 100;Fig.4 Longitudinal section of the midgut in control group.x 50;Fig.5 M ucous folds of midgut in control group.x 200;Fig.6 Transverse section of hepatopancreas in control group.x 100;Fig.7 Hepatopancrentic cell of control crayfish.x 200;Fig.8 Connective tissue of the stomach in starvation group.x 100;Fig.9 Longitudinal section of the midgut in starvation group.x 50;Fig.10 Mucous folds of midgut in starvation group.x 200;Fig.11 Transverse section of hepatopancreasin starvation group.x 100;Fig.12 Hepatopancrentic cell of starveling crayfish.x 200.In figures:CT:Connective tissue.MF:Mucous folds.HC:Hepatopancrentic cell.

图版ⅡPlateⅡ图1.对照组中肠扫描电镜图,示皱壁明显,微绒毛密集(x 3000);图2.对照组肝盲管扫描电镜图,示分泌物丰富(x 5000);图3.饥饿组中肠扫描电镜图,示皱壁变浅,微绒毛减少(x 3000);图4.饥饿组肝盲管扫描电镜图,示分泌物减少(x 1000);图5.对照组胃几丁层下上皮细胞线粒体(x 15k);图6.饥饿组胃几丁层下上皮细胞部分线粒体肿胀,嵴大部分消失(箭头所示,x 15k);图7.饥饿组中肠上皮细胞嵴断裂(箭头所示,x 20k);图8.饥饿组肝胰腺R细胞线粒体嵴大部分消失(箭头所示,x 15k);图9.饥饿组肝胰腺表面微绒毛下细胞线粒体空泡化(箭头所示,x 15k);图10.饥饿组肝胰腺细胞萎缩、核变形(x 4000);图11.对照组肝胰腺F细胞粗面内质网周围丰富的糖原颗粒(x 20k);图12.饥饿组肝F细胞粗面内质网肿胀、糖原颗粒消失(箭头所示,x 15k);图13.对照组肝胰腺R细胞脂滴丰富(x 5000);图14.对照组 R细胞脂滴周围丰富的线粒体(x 6000);图15.饥饿组肝胰腺R细胞脂滴消失(x 15k)图中:Mv微绒毛;Se分泌物;CL几丁质;Ld脂滴。图5～图15,比例尺:500nm.Fig.1 Showing mucous folds and dense microvilliin midgut lumen of control crayfish,observed by SEM.x 3000;Fig.2 Showing abundant secretion on the tubular type gland surface of control crayfish,observed by SEM.x 5000;Fig.3 Showing mucous folds decreased in size and number and microvilli sparse in midgut lumen after 20 d starvation,observed by SEM.x 3000;Fig.4 Showing decreased secretion on the tubular type gland surface after 20 d starvation,observed by SEM.x 1000;Fig.5 Showing abundant mitochond rion in stomach epithelium under chitin layer in control cray fish.x15k;Fig.6 Showing ruptured cristaes of mitochondrion in stomach epithelium under chitin layer after 20 d starvation(arrow).x15k;Fig.7 Showing ruptured cristaes of mitochondrion in midgut epithelium after 20 d starvation(ar row).x20k;Fig.8 Showing ruptured and disappeared cristaes of mitochondrion in R cell after 20 d starvation(arrow).x15k;Fig.9 Showing the mitochondria vacuolated and the ridge of mitochondria ruptured in the cell of the hepatopancrentic epithelium(arrows).x15k;Fig.10 Showing hepatic cell shrank in size and nucleus deformed after 20 d starvation.x 4000;Fig.11 Showing abundant glucogen particals surrounding the rough endoplastic reticulum in F cell of control hepatopancreas.x20k;Fig.12 Showing disappeared glucogen particals and swollen rough endoplastic reticulum in F cell after 30d starvation(arrow).x15k;Fig.13 Showing abundant lipid d roplets in R cell of the normal hepatopancreas.x5000;Fig.14 Showing abundant mitochondrion surrounding lipid droplets in R cell of the normal hepatopancreas.x6000;Fig.15 Showing disappeared lipid d roplets in R cell after 20 d starvation.x15k.In figures:Mv:Microvilli;Se:Secretion;CL:Chitin layer;Ld:Lipid droplet.Fig.5～Fig.15,scale:500nm.

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