I型犬腺病毒黑龙江株(CAV-H)的分离、鉴定及致弱的研究

刘大飞，王牟平，曲连东，高 艳，刘立奎，柴洪亮，刘春国，杨天阔，华育平*，张洪英*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001；2.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150040)

犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，与人腺病毒具有相似的基因结构[1-2]。根据其血凝等不同特性可将CAV分为1型(CAV-1)和2型(CAV-2)[3]。CAV-1与CAV-2之间纤突蛋白的核酸同源性约为80%[4]。CAV-1于1925年首次被发现，1984年，我国首次分离出该病毒。CAV-1在临床上可导致犬传染性肝炎、狐狸和熊脑炎等疾病的发生[5]。

目前，用于CAV防制主要有弱毒苗和单价或多价灭活苗[6]。而这些疫苗大部分为国外疫苗的复制品，由于病毒种背景不明以及在细胞内多次传代等因素，免疫原性和安全性难以得到保证[7]。本研究将CAV-H株接种MDCK细胞，连续传代进行致弱，结果表明，CAV-HR株具有良好的免疫原性，可以对同源强毒攻击的犬提供较好的免疫保护作用，同时为CAV单苗或联苗的研制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病料和细胞 病料采自黑龙江省某养殖场发病犬的肠内容物；犬肾传代细胞MDCK(74代～94代)购自中国兽医药品监察所。

1.2 实验动物 2月龄～4月龄beagles犬(CAV抗体效价≤1∶2)购自哈尔滨医科大学实验动物学部。

1.3 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体和DH5α感受态细胞均购自宝生物工程(大连)公司；DNA提取试剂盒购自Promega公司；胶回收(小量)试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.4 病毒的分离 取患病犬肠内容物捣碎后用MEM细胞营养液制成1∶9的悬液，5000r/m in 10m in，经过滤后置-20℃保存。待MDCK细胞长成单层后，弃生长液，按培养液量体积的1/10接种悬液，37℃吸附30m in，加2%维持液培养4d～5d，每天观察细胞病变(CPE)。

1.5 病毒鉴定

1.5.1形态学鉴定取第5代病毒细胞培养物作负染色，电镜下观察病毒形态。

1.5.2HA试验及TCID50的测定取第5代病毒细胞培养物分别与1%的鸡、猪、人“O”型、豚鼠和大鼠红细胞进行HA试验。将第5代病毒细胞培养物10倍稀释，取 10-8～10-5，分别接种于 4瓶MDCK单层，每瓶1m L。于37℃培养96h，观察CPE并计算TCID50。

1.5.3PCR鉴定参考GenBank中登录的CAV-1和CAV-2全基因组序列，设计引物：E3-F：5'-CCTTGCCTTCTACATCTAT-3'； E3-R： 5'-GGACC CAGAAGTCTTGAC-3'。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。反应条件为：94℃4min；94℃30s、55℃1m in、72℃ 45s，30个循环；72℃ 10m in。回收PCR产物连接于pMD18-T载体中，构建重组质粒，经PCR鉴定，由宝生物工程(大连)有限公司测序，并与GenBank登录的CAV序列进行比较分析。

1.5.4动物回归试验将10只2月龄～4月龄beagles犬随机分成两组，每组5只。试验组皮下接种细胞培养病毒104.0TCID50/犬；对照组皮下接种生理盐水1m L/犬。每天观察并记录两组犬的临床表现，直至接种后第14d。

1.6 病毒的致弱 将CAV-H通过连续同步接种MDCK细胞传110代。分别选取第5代、10代、20代、30代、50代、70代、90代和110代种毒以105.5TCID50/犬剂量接种，每代次接种5只犬，连续观察14d，每天观察犬发病及死亡情况。

1.7 弱毒株免疫效力评价 20只2月龄～4月龄犬随机分组，每组5只。免疫组：A组(第90代)、B组(第 105代)和 C组(第 110代)，接种剂量为104.0TCID50/犬，对照组：D组接种灭菌生理盐水1m L/犬。21d后4组犬皮下攻击同源强毒，剂量为200TCID50/犬。攻毒后观察21d，每天观察发病及死亡情况。

2 结果

2.1 病毒分离结果 CAV接种MDCK单层后，第2代细胞36h开始肿大、变圆，逐渐形成葡萄串状CPE。

2.2 病毒鉴定

2.2.1形态学观察结果负染后的CAV细胞培养物，电镜下可见典型腺病毒粒子团，单个病毒呈20面体对称结构，直径70nm左右，表面无囊膜，在衣壳的顶端偶见纤维突(图1)。

2.2.2HA试验及TCID50测定结果CAV-H第5代细胞培养物在4℃和37℃除对大鼠和人“O”型红细胞具有较好的凝集作用外，对豚鼠的红细胞也有凝集作用。CAV-H株病毒滴度由第5代的105.0TCID50/0.1m L上升至第110代的107.0TCID50/0.1m L。

2.2.3PCR鉴定结果分离株CAV-H PCR扩增结果显示，在500bp左右有一特异性条带，与预期片段大小(534bp)相符(图 2)。

2.2.4动物回归试验结果以CAV-H第5代细胞分离病毒液感染健康犬6d后，试验组5只犬先后发病，并且症状并不相同，以双相热、眼鼻流水、呕吐、腹泻为主，呕吐物一般多为带血胃液，血便呈果酱样。其中，2只犬分别于8d～10d发病死亡，对照组临床无异常(表1)。

表1 动物回归试验结果Table 1The regression test in dogs

2.3 病毒致弱结果 CAV-H株经MDCK传代后对犬的致病力逐渐减弱，第5代～第50代对犬的致病力均由100%下降至20%，病死率由40%下降为0。发病犬出现双相热、眼鼻流水、呕吐、腹泻等症状，呕吐物一般多为带血胃液，血便呈果酱样。对照组均正常(表2)。

2.4 弱毒株免疫效力评价结果 免疫组(A、B、C组)犬在接种后21d，皮下攻同源强毒，观察21d无发病现象，无死亡；而对照组(D组)犬则全部发病，病死率为40%。发病犬表现为体温升高平均在40℃左右、鼻流清液、排稀便等临床症状(表3)。

表2 CAV-H株致弱评价结果Table 2The evaluation of pathogencity for CAV-H in different passages

表3 CAV-HR株免疫效力试验Table 3The protection of immunized dogsw ith CAV-HR against CAV challenging

3 讨 论

本实验采用同步接毒方法，在吹打胰酶消化细胞块时对残留胰酶不作彻底洗涤。微量胰酶残留，是否是病毒分离成功的主要因素，需要进一步试验证明。

CAV-1和CAV-2在E3区的ORF分别编码195个氨基酸和425个氨基酸的多肽，在E3区CAV-2比CAV-1多500bp左右[9]，因此我们设计用于亚型鉴定的扩增引物，经PCR鉴定，本试验分离到的CAV株为I型病毒，命名为CAV-H株。

疫苗接种是防控CAV感染的最有效措施。1954年，Fieldsteel等首次研究CAV弱毒疫苗，将Cabasso分离的犬传染性肝炎病毒适应犬肾原代细胞株，在犬肾上连续传51代后，发现其对敏感动物已不致病[8]。此后，国内外研究者开发出各种单价或多价CAV弱毒苗，且这类疫苗的免疫效果也逐步得到人们的认可[10-12]。目前以上疫苗均存在不足，因此研制廉价高效的CAV疫苗具有十分重要的意义。本研究的CAV-H经连续传代致弱后，病毒的毒价稳定，安全性好，免疫原性优良。为研制防控犬传染性肝炎和狐狸脑炎病单价苗或多价苗奠定了基础。

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