超早期高压氧对脊髓完全横断损伤大鼠血液生化及后肢运动功能的影响

童敏，伍贤平，陈军，刘敏

(1.中南大学湘雅二医院动物实验室，长沙 410011;2.中南大学湘雅二医院代谢内分泌所，长沙 410011; 3.中南大学湘雅二医院康复科，长沙 410011)

研究报告

超早期高压氧对脊髓完全横断损伤大鼠血液生化及后肢运动功能的影响

童敏1，伍贤平2，陈军1，刘敏3

(1.中南大学湘雅二医院动物实验室，长沙 410011;2.中南大学湘雅二医院代谢内分泌所，长沙 410011; 3.中南大学湘雅二医院康复科，长沙 410011)

目的探讨超早期高压氧(HBO)治疗对脊髓完全横断损伤模型血液生化及后肢运动功能的影响。方法55只SD大鼠随机分为A组(假手术组，15只)、B组(模型组，20只)及C组(高压氧组，20只)，A组仅行椎板切除术，其余2组均行T10椎板水平脊髓完全横向切断术。B、C组均予常规护理，C组于术后3 h置于动物舱内开始高压氧治疗，10 d一疗程，共3疗程。分别于建立模型后第1～6周末，用BBB运动功能评分法评价并比较两组大鼠后肢运动功能恢复程度，术后第6周过量麻醉处死大鼠，以40 g/L多聚甲醛行心室－主动脉灌注，取脊髓损伤区标本，光镜观察损伤脊髓的组织病理学改变。检测血钙(Ca)、血磷(P)、血清碱性磷酸酶(ALP)改变情况。结果B、C两组大鼠术后第1～6周BBB运动功能评分逐渐增高，C组在3～6周末的BBB运动功能评分均明显高于B组。B组、C组血钙、血磷在术后1、3周高于A组，血清碱性磷酸酶(ALP)术后1、3周低于A组;C组血钙、血磷在术后5、6周低于B组。病理组织切片观察C组较B组组织水肿减轻，炎性细胞浸润减轻。结论超早期高压氧治疗能促进脊髓完全横断损伤大鼠后肢运动功能的部分恢复，降低血钙、血磷含量，对脊髓完全横断损伤大鼠具有保护和治疗作用。

高压氧;脊髓损伤;运动功能;BBB评分;血液生化

图1 假手术组Fig.1The histological aPPearance of the sPinal cord of a rat from the sham grouP.

图2 模型组Fig.2The histological aPPearance of the sPinal cord of a rat from the model grouP.

图3 高压氧组Fig.3The histological aPPearance of the sPinal cord of a rat from the the hyPerbaric oXygen grouP.

脊髓完全横断损伤(complete spinal cord transection injury，CSCT)是一种严重的神经系统创伤。常常带来难以恢复的感觉运动功能障碍，是临床上至今尚未解决的问题，虽有文献表明高压氧治疗对不完全脊髓损伤功能恢复有促进作用，且越早效果越好［1－2］，但临床观察发现对CSCT患者术后早期采用高压氧综合治疗疗效并不理想，脊髓损伤后抢救的黄金时期是0～6 h［3］，故本研究对CSCT大鼠采用超早期高压氧治疗，通过观察大鼠后肢运动功能的恢复水平及血清中血钙(Ca)、血磷(P)、血清碱性磷酸酶(ALP)含量变化以探讨超早期高压氧治疗对CSCT大鼠脊髓的保护作用。

1 材料与方法

1.1 模型建立

1.1.1 动物来源:SD雌性大鼠55只，体质量250～300 g，来源于中南大学湘雅二医院实验动物室［SCXK(湘)2003－0003］，并按实验动物使用3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 动物分组:将大鼠随机分成3组，即A组(假手术组，15只)，B组(模型组，20只)及C组(高压氧组，20只)。A组仅行T10椎板切除，不损伤脊髓，B组与C组均行T10椎板切除并在该水平横断脊髓。(因实验处理过程中有大鼠因故死亡，故每组最终大鼠数量不一，具体只数见结果)。

1.1.3 手术方法:SD大鼠术前禁食12 h，称重，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 m L/100g体重，水合氯醛购自中南大学湘雅二医院制剂室)，俯卧位固定于手术台上，胸背部剃毛备皮，75%酒精消毒，铺消毒巾。按肋骨确定椎体序列，自背部正中切开T8－12椎体水平的皮肤、皮下及筋膜，剥离竖脊肌，暴露T9－11椎体棘突及双侧椎板。模型组与高压氧组均切除T10椎板，充分暴露T10椎体水平的脊髓，以弯头眼科镊轻轻挑起脊髓并用尖锐刀片横切脊髓，大鼠即刻出现摆尾，双下肢抽搐或尿失禁，以无菌纱布按压止血后逐层缝合。假手术组仅行T10椎板切除，不损伤脊髓，之后逐层缝合。制成脊髓损伤模型。

1.1.4 护理:术后每只大鼠肌内注射青霉素16万U/d，连续1周。每日定量供应充足饲料和水，在安静、通风、清洁环境下分笼饲养。B、C组两组均采用相同的护理，人工排尿:术后每日早晚2次，排尿时，左手撑起大鼠腹部，右手触摸找到充盈的膀胱，然后按住膀胱底，自上而下轻柔挤压，逼尿排出。

1.2 高压氧治疗

C组在脊髓损伤后3h即开始高压氧治疗。将武汉七零一研究所提供的婴儿纯氧舱(YLC0.5/1A型)改作动物舱使用，门缝洗舱法［4］洗舱10 m in至舱内氧浓度达93%～95%，将舱门关紧，20 m in内加压到2.2个绝对大气压(ATA)，稳压40 m in(吸氧浓度97%～99%)，后用15～20 m in匀速减至环境压出舱。为保持舱内氧浓度稳压全过程持续低流量等量换气。10 d一疗程，共三个疗程，其中第一疗程每日2次，第二、三疗程每日1次，每疗程休息6 d。

1.3 运动功能评分

参照Basso等［5］提出的大鼠CSCT后功能评判标准(简称BBB评分法)对各实验动物后肢进行评分。BBB评分为总分21分的运动功能评分，考察大鼠后肢的运动、躯干的位置和稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置，表示SCI后大鼠后肢运动功能恢复的过程。BBB评分简单直观，易于掌握，与脊髓功能恢复有极好的一致性，将大鼠置于直径1 m的平面光滑场地自由活动5 m in，记录大鼠后肢运动情况。自术后第1～6周末由掌握评分标准的固定3人进行盲评。

1.4 标本采集

分别于术后1、3及5、6周评分后采大鼠眶动静脉血1 m L，血液离心取血清，放于－20℃的冰箱冷冻保存备用。取材固定和切片:以水合氯醛腹腔过量(600 mg/kg)麻醉后，开胸，剪开右心耳，另外经心尖插管至升主动脉，在室温条件下，先以150 m L生理盐水快速滴注，至流出液清亮为止。继以250 m L含0.1 moL/L PBS(pH 7.2～7.4)的4%多聚甲醛灌注固定，固定液先快速滴注15 min，然后维持滴注4～5 h，以横断处脊髓为中心，取出长约1.5 cm的脊髓组织，并以4%多聚甲醛继续固定3 h。保留横断处头、尾两侧各约0.5 cm脊髓，常规行冠状面连续切片，片厚5 μm。

1.5 统计学方法

用SPSS11.5统计软件分析，采用单变量方差分析(ANOVA)，组间比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 一般情况观察

A组大鼠术后第1天功能恢复正常。B组、C组大鼠均出现了极为典型的截瘫综合征，双后肢及尾无活动。术后1周活动较少，饮食少。B组大便困难伴硬结，尿潴留、肌张力低、下肢肿胀，部分鼠足部发生溃疡，足趾甚至脱落，无明显对热、触、痛刺激的反射; C组2周后部分鼠有明显的后肢运动，平地拖动，有明显的热、触、痛刺激的反射，下肢肿胀恢复明显，尿潴留、尿路感染和褥疮等并发症的发生也明显降低。实验期间中B组、C组分别有8只、5只死亡。

2.2 BBB运动功能评分

本实验采用BBB评分方法对大鼠CSCT后6周的后肢运动功能进行评分。BBB评估系统认为正常状态为21分，后肢全瘫为0分。结果发现CSCT后24 h A组评分为21分，功能恢复正常。B组、C组均出现了极为典型的截瘫综合征，双后肢及尾无活动，BBB评分为0分。术后第2周，B组、C组后肢运动功能均有所改善，但两组差异并不明显。C组术后第3周部分鼠开始恢复后肢关节运动功能，后肢肌肉萎缩程度较B组轻，与B组相比差异有显著性(P＜0.05)。详见表1。

表1 三组大鼠不同时间点后肢运动功能BBB评分比较(±s)Tab.1 BBB scoring of the rats in the three groups at different times after CSCT(±s)

表1 三组大鼠不同时间点后肢运动功能BBB评分比较(±s)Tab.1 BBB scoring of the rats in the three groups at different times after CSCT(±s)

注:与同组上一个时间点比较:﹟P＜0.05;△P＜0.05;与A组同一时间点比较:﹟P＜0.01;△P＜0.01;与B组同一时间点比较:△P＜0.05Note:﹟P＜0.05，△P＜0.05:compared with the last week's scoring:﹟P＜0.01，△P＜0.01:compared with the group A at the same time:△P＜0.05:compared with the group B at the same time.

组Group数n第1周First week第2周Second week第3周Third week第4周Fourth week第5周Fifth week第6周Seventh week A组15 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 21.00±0.01 B组12 0.17±0.34 1.08±0.22﹟2.52±0.65﹟2.74±0.43﹟3.55±0.32﹟4.58±0.39﹟C组15 0.35±0.31 1.98±0.12 5.22±0.15△6.35±0.23△7.15±0.42△8.38±0.39△

2.3 组织病理学观测

假手术组(图1)大鼠脊髓灰、白质组织结构完整，神经细胞在灰质中分布均匀，形态正常，白质内神经纤维排列整齐，细胞间质均匀。模型组(图2)损伤区灰质出现大片出血，细胞肿胀，细胞空泡变性。高压氧组(图3)与模型组(图2)相比，白质水肿减轻，炎性细胞浸润减轻，空泡变性减轻。详见图1～3。

2.4 血液生化结果

血清样品经Hitachi7170A自动生化分析仪自动采样化验。B组、C组血钙、血磷在术后1、3周高于A组(P＜0.05)，血清碱性磷酸酶(ALP)术后1、3周低于A组(P＜0.05);C组血钙、血磷在术后5、6周低于B组(P＜0.05)。结果见表2。

3 讨论

3.1 超早期高压氧对脊髓完全损伤大鼠后肢运动功能的影响

脊髓损伤动物模型的研究中，后肢运动功能观察可客观评价干预措施对脊髓损伤修复的效果，本实验中结果显示假手术组与其他两组比较，双后肢BBB评分均明显高于其他两组，差异有显著性(P＜0.01)，说明造模成功。模型组在没有接受任何治疗的情况下、双后肢运动功能在1～6周末有一定程度恢复，这种自发的后肢运动功能恢复是低等动物具有的一种脊髓功能代偿形式而并非由脊髓组织修复引起［6］。超早期高压氧组术后3～6周末BBB评分与模型组比较，均明显高于模型组，差异有显著性(P＜0.05)，说明超早期高压氧治疗对CSCT后肢运动功能有一定改善。分析其可能的机理:脊髓损伤后神经细胞水肿以及氧自由基引发的脂质过氧化，造成脊髓微循环障碍。脊髓神经组织因缺血缺氧出现继发性变性是脊髓功能难以恢复的主要原因［7］。超早期高压氧是在脊髓损伤后3h即开始治疗，处在抢救损伤脊髓的黄金时期［8］，此期脊髓白质尚无水肿［9］，可通过提高血氧分压，增加血氧含量及氧弥散，迅速改善组织的缺氧状态。光镜下组织病理学检查发现:与B组相比，C组经超早期高压氧治疗后，脊髓组织的出血、水肿明显减轻，坏死区范围减小，神经功能评分改善。提示超早期高压氧可能抑制和减轻脊髓水肿发生，从而可有效阻止脊髓的继发性损伤，促进原发性损伤细胞功能恢复和细胞正常代谢，促进脊髓功能恢复。

表2 大鼠生化指标测量结果(±s)Tab.2 The results of biochemical parameters of the rats

表2 大鼠生化指标测量结果(±s)Tab.2 The results of biochemical parameters of the rats

注:与A组比较:﹟P＜0.05;与B组比较:△P＜0.05Note:﹟P＜0.05:compared with the group A;△P＜0.05:compared with the group B.

组别Group周Time (week) n血碱性磷酸酶(U/L)血磷P (mmol/L)血钙Ca (mmol/L) A组1 15 123.17±12.34 1.17±0.34 2.35±0.08 3 15 124.21±12.34 1.57±0.17 2.22±0.07 5 15 126.32±12.34 1.47±0.08 2.23±0.11 6 15 127.13±7.23 1.49±0.11 2.38±0.05 B组1 20 65.11±10.23#2.51±0.23#2.81±0.13#3 17 94.02±8.34#2.81±0.13#2.86±0.03#5 16 127.32±3.12 2.41±0.12 2.36±0.03 6 12 128.24±2.24 2.55±0.17 2.26±0.16 C组1 20 68.01±8.24#2.41±0.14#2.76±0.35#3 16 78.02±7.25#2.76±0.15#2.83±0.22#5 15 124.12±2.18 1.61±0.02△1.91±0.04△6 15 118.24±7.34 1.55±0.13△1.85±0.12△

3.2 超早期高压氧对脊髓完全损伤大鼠血液生化的影响

脊髓损伤后肢体废用，骨质缺乏正常的力学刺激，导致骨形成减弱，骨流失增强，表现为骨组织中钙大量释放入血中而致血钙浓度显著上升。本实验中，模型组、高压氧组大鼠血钙、血磷于脊髓损伤后第1周、第3周均明显高于假手术组，ALP均低于假手术组，差异有显著性(P＜0.05)，提示在脊髓损伤早期破骨活性增强，骨吸收增强，成骨代谢受到严重抑制，骨形成减弱［9］。两组在第5、6周血钙、血磷均逐渐下降。提示可能随脊髓损伤时间延长，局部神经体液因子、内分泌逐渐稳定，同时前肢继续负重，存在利于骨形成因素［10］。以上生化结果表明脊髓损伤后成骨代谢早期有一个显著抑制期，而破骨活性则逐渐增强，随着破骨代谢的加强，成骨代谢则由抑制状态恢复到正常水平。高压氧组第5、6周血钙、血磷明显低于模型组(P＜0.05)，相对而言，ALP值有轻度升高趋势，但无统计学意义。说明超早期高压氧治疗对脊髓完全损伤大鼠骨钙流失有保护作用。其机制可能:钙是一种重要的二价阳离子，参与机体细胞的各种代谢过程。脊髓损伤引起细胞膜对Ca2+通透性增加，Ca2+泵失活及突触末梢释放兴奋性氨基酸而导致Ca2+大量内流，血钙反映骨吸收，当骨吸收增强，较多矿物质吸收入血，血钙上升［11］，钙超载所引发的一系列病理生理损害，加重CSCT。超早期高压氧可能通过提高细胞膜的抗氧化能力，减少细胞外钙离子内流，保护脊髓细胞和组织结构，促进神经纤维再生和传导功能恢复，对促进骨细胞活性恢复有利。

总之。本研究表明超早期高压氧治疗能促进CSCT大鼠后肢运动功能的部分恢复，降低血钙、血磷含量，对CSCT具有保护和治疗作用，为其临床应用提供了理论基础。

(本文图1～3见彩插6。)

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Effects of Ultra-Early Hyperbaric Oxygen Treatm ent on Blood Biochem ical Param eters and H ind lim b M ovem ent Function in Rats w ith Com p lete Spinal Cord Transection In jury

TONG Min1，WU Xian－Ping2，CHEN Jun1，LIU M in3
(1.Animal Laboatory，2.Institute of Metabolism and Endocrinology，Department of Rheumatism，the Second Xiangya Hospital of the Central South University，Changsha 410000，China)

ObjectiveTo study the effect of ultra－early hyperbaric oxygen(HBO)treatment on hindlimb motor function and the changes of biochemical indexes in complete spinal cord transection rats.M ethods 55 healthy 3－month－old female SD rats were random ly divided into three groups:group A(sham operation group，15 rats)，group B(complete spinal cord transection(CSCT)group，20 rats)and group C(hyperbaric oxygen treatment group，HBO group，20 rats). Rats in the sham operation group underwent laminectomy，while rats in the other 2 groups underwent laminectomy and complete spinal cord transection at the level of the tenth thoracic vertebra.The rats in the HBO group were put in an animal oxygen chamber at the 3rd hour after operation，10 days as 1 course of treatment，for 3 courses，2/d in the first course，1/ d in the second and third courses，respectively，with a 6 days interval between courses.After the model was established，the motor function recovery of hind limb was evaluated by open－field Basso－Beattle－Bresnahan(BBB)scoring，once a weeklasting for 6 weeks.Six weeks after injury，the rats were sacrificed under anesthesia and perfused with 40 g/L citromint through the ascending aorta，samples were taken from the CSCT area and prepared for histopathological examination.The changes of serum biochemical parameters were observed.Results The BBB scores of groups B and C were gradually increased from week 1 to 6，and the BBB scores of group C was significantly higher than that of group B from week 3 to 6(P＜0.05).Compared with the group A，the concentrations of calcium and phosphorus were increased significantly at the 1st and 3rd weeks(P＜0.05)，the concentrations of alkaline phophatase(ALP)were decreased at the 1 st and 3 rd weeks(P＜0.05)in the groups B and C.In the group C the concentrations of calcium and phosphorus were significantly lower than that in the group B at the 5 th and 6 th weeks(P＜0.05).The pathological exam ination of the spinal cord revealed an obvious rerduction of tissue edema and inflammatory infiltration in the rats of group C.ConlusionUltra－early HBO treatment contributes to the motor function recovery of hidnlimb in rats with complete spinal cord trisection injury.Ultraearly HBO treatment can lower the concentration of serum calcium and phosphorus and exert protective effect on the spinal cord in rats.

Hyperbaric oxygen;Complete spinal cord injury;Hindlimb，motor function;BBB scoring;Blood biochemical;Rats

R651.2

A

1005－4847(2010)03－0212－04

2009－09－29

湖南省科技厅资助项目(编号:2008SK3108)。

童敏(1971－)，女，研究方向:实验动物药理学。E－mail:tongmin22626@163.com

刘敏，博士，副教授，E－mail:liumin22626@126.com