脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选①

2010-09-11 10:17:28李学军
中外医疗 2010年28期
关键词:表面抗原脐带血脐血

李学军

(湖南益阳医学高等专科学校 湖南益阳 413000)

脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选①

李学军

(湖南益阳医学高等专科学校 湖南益阳 413000)

目的 对人脐带血间充质干细胞的分离方法、培养条件进行优化筛选。方法 在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果 采用Percoll(1.073 g/m L)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%~70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。

脐带血 干细胞 分离 培养

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能,是组织工程研究中重要的种子细胞来源。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面,分析UCB-MSCs作为间充质干细胞来源的可行性。

1 临床资料

1.1 UCB-MSCs的分离与培养

9份脐血标本均来源于益阳医学高等专科学校附属医院,均获得产妇同意。以等量的PBS缓冲液混匀,缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液(Fercoll,1.073g/m L),650g离心15m in。抽取白膜层细胞,以等量的PBS缓冲液洗涤离心,基础培养液(DMEM/F12,10%胎牛血清、100U/m L青霉素和链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)重悬,接种至100mm培养皿,置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内培养。第5天首次全量换液,之后每周2次换液,2周后达60%~80%融合时,0.25%胰酶(含0.02%EDTA)常规消化传代。

1.2 UCB-MSCs细胞表面抗原分析

分别取第1、5、9代细胞,胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液。含2%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗细胞,室温下分别与CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE及CD45-PE单克隆抗体避光孵育15min。PBS缓冲液冲洗细胞,离心,弃上清。加入含1%多聚甲醛的PBS缓冲液0.3m L,使用同型对照单克隆抗体确定背景标记,流式细胞仪分析细胞表面抗原。

1.3 UCB-MSCs体外增殖能力检测

分别取第1、5、9代细胞,胰蛋白酶消化,接种24孔板,每孔1×104个细胞/m L。胰酶消化并计数,每天计数3孔,绘制细胞的生长曲线。

1.4 统计学处理

应用SPSS 12.0统计学软件处理,结果以均数±标准差表示,采用配对t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的阳性表达率(±s)(n=6)

表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的阳性表达率(±s)(n=6)

原代细胞接种5d后首次换液,细胞呈圆形或短梭形。9d后细胞进入增殖期,形成细胞集落,细胞形态也逐渐向长梭形改变。2周后基本达到70%融合状态,传代培养。传代后细胞分布均匀,呈成纤维样细胞形态,4~5d后可达80%融合。

2.2 细胞表面抗原分析

不同代次UCB-MSCs表面抗原检测结果见表1。第1、5、9代细胞的CD29和CD44均呈较高表达,阳性率在50%~70%左右。CD34和CD45则呈低表达,阳性率不超过5%。

3 讨论

间充质干细胞具有多向分化潜能,是组织工程研究中较为理想的种子细胞,是研究人工组织工程材料的必备条件。以往的文献报道和研究证实,骨髓作为MSCs的来源已经得到证实,并针对骨髓源性的MSCs进行了一积极的探索[1~3]。但随着年龄的增加,骨髓中MSCs的含量明显减少,且受病毒感染机会显著增加,获得骨髓的过程也会造成一定的二次损伤,这些均限制了骨髓源性的MSCs的应用,寻找替代的间充质干细胞来源成为研究者关注的热点。虽然脐血MSCs占脐血单个核细胞(mononuclear,MNC)的比例较小,仅有约25%的脐血样本的MNC含有并经培养后出现MSCs,但脐血MSCs有85%以上处于细胞周期的G0/G期[6]。因此,从脐血中成功分离扩增出MSCs,将作为一种新的MSCs的来源应用于科研和临床。

[1]郑德宇,张玉华,姚素艳,等.人骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷修复颅骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(34):6705~6708.

[2]郑德宇,秦书俭,姚素艳.PcDNA 3-hBM P2转染骨髓基质细胞及其稳定表达[J].中国临床解剖学杂志,2004,22(2):210~213.

[3]StuteN, HoltzK, Bubenheim M, et al.Autologous serum for isolation and expandsion of hum an mesenchym al stem cells for clinical use[J].ExpHemato1,2004,32:1212~1225.

[4]Deans RJ, M oseley AB.M esenchymal stem cells: biololgy and potential clinical uses[J].Exp Haematol,2000,28:875~884.

R329.2

A

1674-0742(2010)10(a)-0027-01

2010-07-19

李学军(1972- ),男,讲师,湖南益阳人,主要从事医学生物学与遗传学教学和科研工作。

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