经典瞬时受体电位通道蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达

张奇 何建行 卢文菊 殷伟强 杨海虹 徐小明 汪道远

钙离子（Ca2+）作为细胞内第二信使，广泛参与细胞各种生命活动。细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）调节主要依靠：肌浆内质网（ER/SR）钙池系统中Ca2+释放以及胞外Ca2+通过离子通道如电压依赖性钙通道（voltage dependent calcium channels, VDCC）、钙池操纵性钙通道（storeoperated calcium channels, SOCC）或受体操纵性钙通道（receptor-operated calcium channels, ROCC）内流[1]。质膜系统钙离子泵和离子交换蛋白同时参与细胞内Ca2+的调节，从而平衡着胞浆与细胞器之间的钙水平。经典瞬时受体电位（transient receptor potential canonical, TRPC）通道蛋白为非选择性阳离子通道家族，包括7个成员，即TRPC1-7。研究表明，TRPC中的部分成员可能参与构成钙池操纵性钙通道SOCC，并介导产生钙池操纵性钙内流（Store-operated calcium entry，SOCE，过去称CCE）；TRPC介导的SOCE在细胞增殖、迁移和基因转录等细胞活动中发挥重要作用[2]。本研究应用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹技术首次检测了TRPC mRNA和蛋白质在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）组织中的表达情况，并初步分析了TRPC与NSCLC细胞中SOCE的形成可能存在的关系，为进一步开展TRPC的功能研究奠定了分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌组织标本的分离与贮存 标本来自于广州医学院第一附属医院呼吸疾病研究所胸外科于2007年10月-2009年3月间收集的24例病例。所有患者术前未做化疗、放疗及其它抗肿瘤治疗；其中男13例，女11例，中位年龄56.5岁（32岁-79岁）；术后病理确诊为NSCLC，病理类型包括：腺癌15例，鳞癌9例。根据1997年UICC分期包括：Ia期5例，Ib期3例，IIa期2例，IIb期2例，IIIa期8例，IIIb期2例，IV期2例。所有新鲜标本在液氮中冻存。

1.1.2 主要仪器与试剂 iCycler IQ5荧光定量PCR仪以及微型凝胶垂直电泳装置购自Bio-Rad公司。Trizol试剂盒为Invitrogen公司（美国）产品。逆转录采用iScript逆转录试剂盒（Bio-Rad公司，美国）。荧光定量PCR试剂使用QuantiTect SYBR Green（Qiagen公司，美国）。引物由TAKARA公司合成。 TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6和β-actin抗体分别购自Alomone公司（以色列）和 Santa cruz公司（美国）。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）、分子量标准Precision Plus和ECL发光液采用Bio-Rad公司产品。RIPA组织裂解液购自上海博彩生物公司。Tris、甘氨酸、Tween-20、DTT、BSA等购自Sigma公司（美国）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA抽提 应用Trizol试剂，按公司产品说明书提取总RNA。用TURBO DNA-ゎee 试剂（Ambion公司）除去总RNA样品中残留的DNA。紫外分光光度法测定A260nm、A280nm光密度，按公式[RNA]（μg/mL）= 40×稀释倍数×A260nm计算RNA浓度；用于本研究的RNA样品质量要求是，A260与A280比值＞1.8，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳清晰可见28s和18s两条区带，带型无弥散。

1.2.2 RNA逆转录 反应体系体积为20 μL，其中含RNA 1 μg，按iScript逆转录试剂盒的说明配制反应体系。逆转录条件为：25oC、5 min；42oC、30 min；85oC、5 min。产物在-80oC保存。

1.2.3 荧光实时定量PCR 按QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒要求配制反应体系：PCR反应总体系25 μL，其中含cDNA 1 μL。引物设计采用Primer 3软件（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），序列见表1，其中Importin（IPO8）[3]为内参基因，用以排除样本间上样量的差异。各样本设置3个复孔，以无模板反应孔为阴性对照，人脑组织cDNA为阳性对照[4]。PCR扩增条件参照文献[5]：①预变性95oC、15 min；②94oC、15 s，57.5oC、20 s，72oC、20 s，共45个循环；③95oC、1 min；④55oC、1 min；⑤55oC→95oC Δt0.5oC、10 s。反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并送TAKARA公司测序，以验证扩增产物的长度和序列，以及扩增的特异性。采用阳性对照（人脑组织）CDNA，进行5个梯度的等比稀释，荧光定量PCR检测得到各基因引物的标准曲线和扩增效率。

1.2.4 蛋白质免疫印迹分析 ①组织总蛋白的提取：从-196oC冰箱取出非小细胞肺癌组织及正常肺组织，在冰上迅速研磨成粉末，按每100 mg组织加入1 mL RIPA组织裂解液，冰上孵育30 min；于4oC、12 000 g离心30 min，收集上清液，为提取的总蛋白；②组织总蛋白定量：采用Bradford方法检测蛋白浓度；③10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质于100oC加热5 min进行热变性，上样量为30 μg；④免疫印迹：采用湿法转膜、5%脱脂奶粉4oC封闭过夜。TRPC一抗进行1:1 000稀释后孵育膜2 h，二抗按1:5 000稀释后孵育膜1 h。用ECL发光液对信号进行检测。X光片曝光、显影、定影。实验以β-actin为上样内参。

1.2.5 数据分析及统计处理 根据各基因引物效率以及未知样品的Ct值，采用Pfaffl方法[6]，计算目的基因表达的初始拷贝数；以IPO8为内参，计算各样本TRPC基因与内参基因IPO8的比值，为基因的相对表达量。组间差异的统计学分析采用t检验。

2 结果

2.1 荧光定量PCR结果 本研究以Gene Bank中发表的mRNA序列为模板，分别设计合成了特异性针对人TRPC1-7基因和IPO8内参基因mRNA的荧光定量PCR扩增引物。以人脑组织cDNA为阳性对照制作荧光定量PCR标准曲线，经反复测定（＞5次），筛选得到扩增效率接近100%、扩增产物的溶解曲线呈现单一峰的一组引物（表1）。另外，扩增产物行琼脂糖凝胶电泳见单一条带且同预计分子量吻合（图1），经测序证实与靶序列匹配率大于99%。

表 1 人TRPC引物信息表Tab 1 Human TRPC primers' sequences and products length

图 1 人脑组织（阳性对照）TRPC和IPO8荧光定量PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。采用所设计的引物（表1）分别检测到TRPC1-7和IPO8在人脑组织中的表达。电泳显示各基因扩增产物条带单一、大小与预期分子量一致，表明引物特异性好。Fig 1 Agarose gel electrophoresis of TRPC and IPO8 qPCR products. Human brain cDNA was used as the positive control to validate the specificity of TRPC1-7 and IPO8 qPCR primers. Agarose gel electrophoresis indicated a single band with expected size of each qPCR product (TRPC1-7 and IPO8).

应用这些引物，对24例NSCLC患者癌组织中的TRPC进行了检测，结果发现（图2）：NSCLC组织中高表达TRPC1和TRPC6，少量表达TRPC3和TRPC4，统计学分析显示各基因的相对表达丰度为TRPC1≈TRPC6＞TRPC3＞TRPC4，其中TRPC3和TRPC4的表达量分别约为TRPC1的1/8和1/25（两两均值之比，P=0.000 4）；在NSCLC组织中未检测到TRPC2、TRPC5和TRPC7 mRNA的表达。

2.2 TRPC蛋白质免疫印迹结果 以β-actin为内参蛋白，对NSCLC组织中mRNA水平有表达的TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6基因，应用免疫印迹方法验证了其蛋白质的表达，结果表明NSCLC组织表达TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 通道蛋白（图3）。

3 讨论

细胞内Ca2+的稳态平衡与细胞维持正常的生命活动有密切的关系。在生理条件下，SOCC介导的SOCE是非兴奋细胞产生钙离子内流、维持细胞内Ca2+的稳态平衡的重要途径之一：细胞外激动剂作用于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）产生三磷酸肌醇（inositol triphosphate, IP3），IP3与钙池上受体结合后受体开放并迅速释放Ca2+入胞浆，钙池出现钙损耗，效应蛋白感受钙池损耗状态并将信号传递给位于细胞膜的SOCC，后者活化开放引起细胞外Ca2+迅速内流形成SOCE[7]。目前，关于TRPC成员在构成SOCC、介导产生SOCE中的作用虽然仍有争议，但越来越多的研究[2,8]发现，TRPC1、TRPC4和TRPC6在多种不同类型细胞均具有SOCC的功能，比如：在增生的人肺动脉平滑肌细胞，TRPC1表达增加、SOCE增强，经TRPC1反义寡核苷酸处理后，人肺动脉平滑肌细胞增殖和SOCE均受到抑制[9]；在TRPC4基因敲除小鼠血管内皮细胞上记录的SOCE要比TRPC4野生型小鼠低[10]；应用TRPC6反义寡核甘酸能够降低大鼠肺动脉平滑肌细胞表达TRPC6，血小板源性生长因子刺激的SOCE同时受到抑制[11]；TRPC3在低表达时可能参与构成SOCC，但大多数研究[12]认为TRPC3不具有SOCC的功能。病理条件下，SOCE可能发生变化并参与疾病的病理机制[5,9,13]。

图 2 TRPC mRNAAA在 NSCLC组织中的表达谱及表达丰度。荧BB 光定量PCR检测到NSCLC组织表达TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 mRNA，未检测到TRPC2、TRPC5或TRPC7 mRNA的表达；其中TRPC mRNA相对表达丰度为：TRPC1≈TRPC6＞TRPC3＞TRPC4。A：NSCLC组织高表达TRPC1和TRPC6；B：TRPC3和TRPC4在NSCLC组织中呈较低水平低表达，其表达量分别为TRPC1的1/8和1/25（P=0.000 4）；未检测到TRPC2、5或7的表达。Fig 2 Expression profile of TRPC mRNA in NSCLC tissue. TRPC1, TRPC3, TRPC4 and 6 mRNA were detected in NSCLC tissues by real-time qPCR. TRPC2, TRPC5 and TRPC7 mRNA were not detectable； the relative abundance of TRPC mRNA was TRPC1≈TRPC6 ＞TRPC3＞TRPC4. A: TRPC1 and TRPC6 mRNA were highly expressed in NSCLC tissue； B: The expression of TRPC3 and TRPC4 in NSCLC was relatively low, which was about 1/8 and 1/25 comparing to TRPC1(P=0.000 4)； TRPC2, TRPC5 and TRPC7 mRNA were not detectable.

图 3 免疫印迹法检测NSCLC组织中TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6的表达。蛋白质免疫印迹显示TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6蛋白条带，β-actin为上样内参蛋白，免疫杂交信号强度均一，表明NSCLC组织中表达TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6通道蛋白。图中所示为取自3例不同NSCLC组织的代表性数据。Fig 3 Detection of TRPC1, TRPC 3, TRPC 4 and TRPC 6 protein expression in NSCLC tissue by Western blot. Representative data of Western blot from 3 different patients indicate TRPC1, TRPC 3, TRPC 4 and TRPC 6 proteins were expressed in NSCLC tissue.β-actin was used as loading control.

多项肿瘤研究表明，前列腺癌[14,15]表达TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6蛋白，仅TRPC1和TRPC4参与SOCE，引起肿瘤细胞异常增殖和生长；肝癌[16]中可检测到TRPC1和TRPC6，TRPC6介导的SOCE与细胞的恶性增殖有关；TRPC3的表达对卵巢癌[17]的发展有促进作用；胃[18]及食道癌[19]表达TRPC6，乳腺癌[20]则表达TRPC3和TRPC6，其表达与细胞增殖有关；而基底细胞癌[21]不表达TRPC1和TRPC4，缺乏IP3诱发的SOCE，阻碍肿瘤细胞向正常分化。可见，TRPC1和/或TRPC6与大多数肿瘤关系密切。

关于肺癌组织中TRPC的表达、SOCC构成情况、是否存在SOCE异常以及与肿瘤的关系，目前还未有报道。本研究首先探讨了NSCLC组织中TRPC的表达情况，结果表明，NSCLC组织表达TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 mRNA和蛋白质，并未检测到TRPC2、TRPC5和TRPC7基因的表达。进一步分析发现，TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6 mRNA在NSCLC组织中的表达丰度不同，TRPC1和TRPC6高表达，而TRPC3和TRPC4表达丰度远远低于前者。研究[22]表明，SOCC是TRPC通道蛋白以同源或异源方式形成的四聚体通道，NSCLC组织中TRPC的这种表达丰度或许同SOCC的组成方式有关，因此推测，NSCLC的SOCC可能主要由TRPC1和/或TRPC6构成，TRPC3[12]和TRPC4并不主要参与或不参与构成SOCC。

综上所述，本研究首次发现了NSCLC组织中TRPC的表达谱和相对表达丰度，这些TRPC通道蛋白在NSCLC组织中对癌细胞SOCE的贡献及与肺癌进展的关系还有待进一步研究。