耐甲氧西林金黄色葡萄球菌皮肤脓肿小鼠感染模型的建立与评估

王德成，王星，周文江，彭秀华，高谦

(1.教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，复旦大学上海医学院，上海 200032; 2.上海市公共卫生临床中心，复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508)

研究报告

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌皮肤脓肿小鼠感染模型的建立与评估

王德成1，王星1，周文江2，彭秀华2，高谦1

(1.教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，复旦大学上海医学院，上海 200032; 2.上海市公共卫生临床中心，复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508)

目的建立耐甲氧西林金黄葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)小鼠皮肤脓肿感染模型，观察脓肿形成动态变化及药物对脓肿愈合的影响。方法45只SPF级裸鼠随机分为PBS对照组、感染组及给药组，用临床分离鉴定的ST－239型MRSA菌株皮下注射感染裸鼠，对脓肿的形成过程进行时相性观察，测定脓肿体积的变化，并通过H.E染色观察皮肤的组织病理学改变。结果PBS处理组小鼠皮肤无脓肿形成，显微镜下皮肤各层结构清楚;感染组和给药组可见到典型的脓肿，临床症状的时相性过程明显，感染组小鼠皮肤真皮层的胶原纤维消失，可见大量炎性细胞浸润，给药组小鼠的脓肿体积在整个实验周期内低于感染组，且在第5天时与感染组相比有差异。结论成功建立MRSA小鼠皮肤脓肿感染模型，该模型的建立可为进一步研究来源于临床MRSA菌株的病原特性、发病机制、治疗方法等提供可靠的动物模型。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;皮肤脓肿;裸鼠

皮肤脓肿是一种常见疾病，主要发生在躯干，肢端，腋窝或头颈部。导致脓肿形成的原因很多，如细菌感染或创伤等，其最常见的是金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)。脓肿通常在较小的皮肤创伤后产生，可伴随有局限性蜂窝织炎，淋巴管炎和发热等特征。皮肤脓肿不仅能导致直接的皮肤损伤，而且还能导致系列的继发性皮肤病或复发性感染。由于继发性或复发性感染往往可诱发潜在的全身性疾病，尤其是糖尿病或机体免疫功能有缺陷。因此，深入研究皮肤脓肿的病原特性、发病机制和探索有效的防治措施，仍是临床医学领域的重大研究课题之一。

金葡菌是临床和动物生产中的常见的一种重要病原菌，随着各种耐药菌株尤其是耐甲氧西林金葡菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的流行，对人和动物健康及公共卫生安全造成严重威胁［1－5］。金葡菌引起的皮肤疾病在临床上呈多种症状表现，有急性、慢性及亚临床型或潜在性感染。金葡菌可导致皮肤的持续、反复感染，难以痊愈，并长期存在于环境中不易根除。大量抗菌药物的广泛应用，已引起多种药物耐受性菌株的不断产生，从而使治疗更加困难。因此，研究金葡菌的病原特性及其致病机制，对研发皮肤疾病的治疗大有裨益。

建立一种符合临床发病机制的皮肤脓肿动物模型，尤其是建立易操作、成本低、实验结果再现性好的小动物感染模型，对研究本病的发病机制及其防治具有十分重要的价值。本研究探讨了临床分离的MRSA菌株接种裸鼠后诱发的脓肿特征，感染后皮肤脓肿体积的变化及组织病理改变，为进一步开展临床分离菌株造成的皮肤疾病的致病机制研究和治疗药物开发，提供可靠的动物实验感染模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:45只15～20 g左右SPF级的BALB/c裸鼠，来源于上海西普尔－必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2005—0001】，小鼠饲养在ABSL2动物室。本研究的动物感染在上海市公共卫生临床中心动物中心完成【SYXK(沪)—0007】，实验过程中供给专用饲料及饮水，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 MRSA菌株ST－239:菌株由上海华山医院临床检验科李敏博士分离并惠赠，本实验室保存。该菌株为临床分离菌，参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)标准，将细菌培养后进行MLST及SCCmec分型，鉴定该株细菌为ST－239型［6］。

1.2 方法

1.2.1 感染用菌株的培养与制备:ST－239 MRSA菌株的增殖。37℃，ST－239菌株在TSB(trypticase soy broth)培养基中振荡过夜生长，第2天转种新的TSB，当细菌长至对数生长期时，用无菌PBS快速洗涤2次，然后再用无菌PBS悬浮细菌至1×109CFUs/100 μL或1×108CFUs/50 μL。

1.2.2 感染实验:45只裸鼠预饲7 d后，随机分为3组:PBS对照组，ST－239感染组和万古霉素药物治疗组。其中PBS对照组5只。感染组和药物治疗组各20只，在感染组和给药组中以10只为单位，分为两个小组(其中一个小组为采样组，另一组为测定组)。感染组在其右侧腹部皮下注射50 μL含1 ×108cfu的菌液，对照组接种50 μL无菌的PBS，药物组先皮下注射108cfu/50 μL菌液，24 h后在脓肿局部注射万古霉素［150 mg/(kg·w)，购自Am resco公司］。注射前小鼠称重，在注射后10 d内每天称重并测量脓肿的长度与宽径，按照V=(π/6·L· W2)计算脓肿的体积，其中L表示脓肿的长度，W表示宽径。同时，每天随机从采样组中取1只小鼠处死，取感染处的皮肤，常规固定后制作组织切片，进行HE染色。

1.3 皮肤脓肿的病理学评价

1.3.1 皮肤脓肿临床症状的观察:对感染组、药物组和对照组小鼠皮肤脓肿情况进行肉眼观察，记录脓肿部位皮肤颜色变化、是否有溃疡和结痂等状况，并拍照记录。

1.3.2 脓肿体积的测定:每天两次，分别用游标卡尺测定脓肿的长径与宽径，并按照公式［V=(π/6) L·W2］计算脓肿的体积(其中L表示长径，W表示宽径)，直至实验结束。

1.3.3 组织切片制备与观察:每天分别于感染组和给药组中随机取1只小鼠处死，并取脓肿处的皮肤放入4%的多聚甲醛溶液中固定，经石蜡包埋，切片后，进行苏木精－伊红(H.E)染色，于光学显微镜下观察病理组织学变化。比较观察并记录感染组和对照组的病理组织学特征，炎症细胞的浸润部位和数量等。

2 结果

2.1 ST-239 MRSA菌株感染后皮肤脓肿的形成过程

用108CFU的金葡菌经过皮下注射后，第1天可在感染组和给药组小鼠的腹部看到明显的脓肿形成，但在PBS对照组中无任何变化，表明ST－239菌株能够造成皮肤的感染，随着感染时间的延长，感染处的脓肿也发生有规律的变化，在感染后的3～5 d时，部分小鼠感染处的皮肤开始出现溃疡，感染处的皮肤破溃，并有脓汁流出(见图1，彩插7);随着实验的继续，到第7天时，有些小鼠溃疡处的皮肤开始结痂，呈现自动愈合的动态过程。

2.2 M RSA感染后皮肤脓肿的体积变化过程

在整个实验过程中，PBS组的小鼠没有任何异常的皮肤症状出现，而在感染组和给药组中，皮肤脓肿的体积均呈现一个动态的规律，即在感染的早期呈现逐渐增加的趋势，以后逐步降低(图2)，并且体积的变化与我们在临床上观察到的脓肿的动态发展过程相一致。在整个实验过程中，ST－239感染组和给药组小鼠的脓肿的体积在第5天差异有显著性(图2，P＜0.05)，表明药物的使用在脓肿的发展过程有一定的影响，尤其是影响到后期的愈合。

图2 MRSA感染过程中皮肤脓肿体积的动态变化Fig.2 The dynamic changes of the volume of skin MRSA－infected abscesses during the entire experimental period

2.3 不同组别中皮肤脓肿的组织病理学观察

对不同处理造成感染的小鼠，分别于感染后每天取感染处的皮肤组织，常规固定包埋，制作5 μm组织切片，H.E染色后进行观察。镜检发现，整个实验周期内PBS组小鼠皮肤各层结构清晰，表皮层细胞层次分明，细胞结构完整，真皮层中胶原纤维排列有序，结构清晰整齐，毛囊和皮脂腺等结构完整(图3.A－C)。与正常皮肤的完整结构相比，感染组和药物组小鼠的皮肤表皮细胞层次遭到不同程度的破坏，结构模糊不清，真皮乳头层内的皮脂腺结构完全遭到破坏，腺泡浓缩成为一较大空腔。真皮胶原结构遭到不同程度的破坏，在感染组和给药组中胶原纤维断裂，凝聚成片状或条索状，在其中有大量炎性细胞浸润。而受细菌感染的皮肤胶原纤维完全断裂，有大量红染嗜伊红类物质沉积(图3.D－I)。(图3见彩插7。)

3 讨论

MRSA是医院感染中最常见的致病菌之一［7］。由于该细菌广谱耐药，并且传播迅速，被研究者喻为“超级细菌”。MRSA可以感染伤口，包括医疗操作产生的伤口。它可以进一步地进入到人体中，引发严重的传染病，是全球性院内感染的重要致病菌之一［8－12］。还有研究表明，HIV感染者皮肤感染MRSA比普通人群明显高，并且从HIV感染者皮肤组织中分离到相同的菌株，提示MRSA在其他疾病的共感染过程中也发挥了重要作用［13］。

MRSA主要是通过皮肤接触而导致传染，因此容易造成皮肤的感染如脓肿等的形成，或在皮肤受伤后的伤口处理时造成感染。当这种病菌通过伤口入侵患者或免疫力低下的人群后，会造成严重的感染，甚至导致死亡［8－12］。因此，建立皮肤感染模型研究MRSA的致病基因和感染机制，是研究对付这种“超级细菌”的药物的基础。本研究中，我们首次通过皮下注射临床分离的MRSA建立脓肿模型，并对皮肤脓肿形成过程进行了时相性观察，记录了感染过程中脓肿体积的变化，并进一步比较了通过给药处理后皮肤的组织病理学变化。建立了操作简单、实验结果稳定、再现性好、病理变化与自然感染发病相似的小动物皮肤脓肿感染模型。为进一步研究MRSA临床分离株的病原特性，致病机制等提供了可行的小动物感染模型。

金葡菌是临床上导致皮肤疾病的主要原因之一，我们利用临床分离的金葡菌作为感染用菌株，作为一种典型的MRSA菌株，该ST－239型菌株能够导致裸鼠的皮肤病变，由于ST－239型MRSA在我国及东南亚地区的广泛流行，暗示该型细菌具有重要的临床意义［14－16］，因此该小鼠感染模型的建立对进一步研究该型菌株的基因功能和致病机制提供了很好的参考作用。

在本研究中感染组和给药组的小鼠均表现为明显的发病过程，通过对脓肿形成的时相性观察和脓肿体积的测定，发现两组小鼠的脓肿都比较明显，但总的趋势是给药组小鼠的脓肿体积在整个实验过程中低于感染组，并且在第5天时差异有显著性，这可能与我们在实验过程中使用的药物剂量相对较低有一定关系，结果提示我们虽然给药不能完全治疗感染的脓肿，但在一定条件下能加速康复进程。本研究为进一步研究MRSA皮肤感染过程中的治疗药物的研制和药效比较等提供了依据。

综上所述，我们用临床分离的ST－239型MRSA菌株，经皮下注射感染方法，成功建立了小鼠的MRSA皮肤脓肿感染模型。该动物模型能够全程监测脓肿形成的时相性过程，具有操作简单、结果稳定及再现性好等特点，为进一步研究MRSA皮肤感染疾病的发病机制和治疗效果比较等提供了可靠的动物模型和实验基础。

(致谢:感谢上海华山医院检验科李敏副研究员提供ST－239型MRSA菌株。)

(本文图1，图3见彩插7。)

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Establishm ent and Evaluation of a M ouse M odel of Skin Abscess by In fection w ith an Isolated M ethicillin-Resistant Staphylococcus aureus(MRSA)Strain

WANG De－cheng1，WANG Xing1，ZHOU Wen－jiang2，PENG Xiu－hua2，GAO Qian1
(1.Key Laboratory of Medical Molecular Virology，Shanghai Medical College，Fudan University，Shanghai200032，China;2.Shanghai Public Health Clinical Center，Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University，Shanghai 201508)

ObjectiveTo establish a skin abscess model in nude mice by infection of a clinically isolated methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA)strain，and evaluate the dynam ics of abscess formation and drug effect.MethodsForty－five specific pathogen free nude mice were random ly divided into three groups:the PBS，MRSA－infected and durg－treated infected groups.All the mice were inoculated by subcutaneous injection of MRSA suspension and the kinetics of abscess formation was monitored.The clinical changes and abscess volume were examined during the whole experimental period.Finally，the abscesses in different groups were examined and compared by histopathological observation using HE staining.ResultsThere were no skin abscess formed in the PBS group during the experimental period.Skin abscesses were observed in the MRSA－infected and drug－treated MRSA－infected groups.The volume of skin abscess was higher in the MRSA－infected mice than that in the drug－treated MRSA－infected animals.Moreover，severe histopathologic changes were observed in the MRSA－infected mice.ConlusionA nude mouse model of skin abscess has been successfully established by MRSA－infection.This model will provide a useful tool for studies on the pathogenic characteristics and pathogenesis of skin abscess caused by MRSA infection，and promote the development of effectivetherapeutic approaches in the future.

Methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA);Skin abscess;Nude mice

R－33

A

1005－4847(2010)03－0221－04

2009－12－02

上海市科委资助项目(编号:07DZ19503)。

王德成(1976－)，男，博士，研究方向:重要人畜共患病动物感染模型的建立。Tel:021－54237971，E－mail:wdc268@yahoo. com.cn