抑癌基因RASSF1A与RASSF1B基因的关系

刘新法 陈明军 谢国柱 陈吉祥

(1.江苏省泰州市人民医院,江苏 泰州 225300;2.江苏大学附属医院,江苏 镇江 212001)

人类恶性肿瘤都是多基因病变,其发生和发展不仅与细胞异常增殖的肿瘤基因(ocogene)变异及高表达有关,也直接和细胞中的抑制细胞突变和异常增殖的抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)功能失活相关。Dammnn等[1]利用酵母双杂交筛选的方法从染色体3P21.3内120 kb长最小纯合缺失区分离出一种能与DNA修复蛋白XPA相互作用的基因,由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)与小鼠RAS相关区域家族1(RAS association domain family 1)及小鼠RAS效应蛋白Nore1高度同源,遂命名为RAS相关区域家族1,即RASSF1基因。由于选择性剪切和不同启动子的使用,RASSF1基因至少存在7个不同的转录本(转录本A～G)。研究[2]发现,RASSF1基因能直接参与细胞周期的调控,在体内和体外能抑制细胞生长,并参与诱导细胞凋亡。

本研究通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,检测RASSF1家族中2个最主要的转录本在胃癌组织及相应癌旁组织中的表达情况,以及论证两者之间有无相关协调表达,为基因治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 试验材料 胃癌组织标本取自2009年1月—2010年2月在我院胃肠外科手术的胃癌患者,共40例,均经病理确诊,所有患者术前未经放、化疗。所有标本均在-70℃冰箱保存待用

1.2 cDNA的制备 以 Trizol方法提取细胞总RNA并纯化,用MMLV反转录得到5种肿瘤细胞的cDNA。

1.3 RT-PCR 利用DNAstar软件设计RASSF1家族2种转录本的特异引物,以人β-actin为内参,通过RT-PCR方法检测这2种转录本在胃癌组织与癌旁组织的表达情况。引物序列如下：RASSF1A扩增引物为：5'ATTGCAAGT TCACCTGCCAC3'(上游引物),5'CTTCCTACGTATCCTGCAGCGG3'(下游引物);RASSF1B扩增引物为：5'AGCT TGAACAAGGACCTGT T3'(上游引物),5'CT TCCTACGTATCCTGCAGCGG3'(下游引物);以人β-actin为内参,引物序列为：5'GAGACCT TCAACACCCCAGCC 3'(上游引物)5'GGCGTACAGGTCTT TGCGGATG 3'(下游引物),反应条件：95℃2 min,94℃15 s,58℃30 s,72℃1.5 min,30个循环,72℃10 min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 统计学分析 所有数据分析均应用于SPSS 9.0软件。组间比较采用卡方检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 总RNA的提取结果 提取胃癌组织与癌旁组织的总RNA。琼脂糖凝胶电泳的结果显示,18S和28S条带较为明显,RNA的完整性和质量较好(图1)。采用核酸检测仪(Gene SpecⅢ)检测,A260/A280值均在1.9～2.0,其结果与电泳的结果一致,各项指标均达到反转录要求。

图1 琼脂糖电泳检测总RNA

2.2 2种转录本在胃癌组织与癌旁组织中的表达状况 应用RT-PCR方法检测上述2种转录本的表达状况(图2);RASSF1A基因在40例胃癌组织中表达缺失率为60.2%(24/40),在对应的癌旁组织中表达缺失率为22.3%(9/40),RASSF1B基因在40例胃癌组织中表达缺失率为37.5%(15/40),在对应的癌旁组织中表达缺失率为10%(4/40)。

2.3 2种转录本相关性分析 RASSF1A和RASSF1B在胃癌组织中的表达无显著相关(P＞0.05)。RASSF1A基因在胃癌组织中表达明显缺失,癌旁组织中表达量显著高于胃癌组织(t=4.623,4.022,P＜0.05),两者有显著差异,RASSF1B基因在胃癌组织及癌旁组织中均有表达,但无显著差异。

图2 RASSF1基因2种转录本在胃癌及癌旁组织中的PCR扩增

3 讨 论

有研究[3]表明,在一些基因家族中,各转录本之间存在协调表达,一旦表达平衡被打破,就会导致细胞不正常的增殖。因此,在不同的肿瘤组织中分析各转录本表达比例的变化可以分析各转录本与肿瘤发生间的关系。本研究结果表明,2个转录本的表达有较大差异,尤其是RASSF1A基因在胃癌及癌旁组织中的表达有显著差异(P＜0.05)。尽管RASSF1B基因在胃癌及癌旁中表达不同,但是无显著差异,并且两个转录本基因在胃癌中的表达情况也无相关差异(P＞0.05)。

RASSF1A基因位于人类染色体3p21.3[4],是RASSF1基因家族A、B、C中的一员。其cDNA序列中含有 6 个外显子(1α、2α β、3、4 、5 和 6)共1873 bp核苷酸,编码由340个氨基酸组成的蛋白多肽,其相对分子量为38800,N端与富含半胱氨酸的甘油二脂或佛波酯结合区高度同源,也被称作蛋白激酶C保守区,它的生物学功能目前还未完全了解。RASSFlB基因与 RASSF1A基因主要的差别在于中部存在少数氨基酸的不同剪接方式,在正常组织和肿瘤组织中均有表达。本研究发现RASSF1A基因在胃癌组织中的表达缺失率极高,将RASSF1A基因转染入不表达该基因的癌细胞株后,可显著抑制肿瘤细胞的克隆形成和非贴壁肿瘤细胞的生长,接种裸鼠后其成瘤生长能力也明显下降,由此可以进一步认为RASSF1A基因在肿瘤发生发展中起到重要的抑制作用。可初步推断RASSF1A基因可以作为肿瘤组织,尤其是胃癌的肿瘤血清标志物。关于这2个主要转录本的表达失衡机制与两者之间的关系目前尚不明了,还需通过更大样本量的肿瘤组织及不同的肿瘤细胞系作进一步研究。

1 Williams MD,Chakravarti N,Kies MS,et al.Implications of methylation patterns of cancer genes in salivary g land tumors[J].Clin Cancer Res,2006,12(24)：7353-7358.

2 Dammann R,Li C,Yoon JH,et al.Epigenetic inactivation of a ras association domain family protein from the lung tumor suppressor locus 3p21.3[J].Nat Genet,2000,25(3)：315-319.

3 Chen H,Suzuki M,NakamuraY,et al,Aberrant methylation of RASGF R2 and RASSF1A in human non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2006,15：1281-1285.

4 Baksh S,T ommasi S,Fenton S,et al.The tumor suppressor RASSF1A and MAP-1 link death receptor signaling to Bax conformational change and cell death[J].Molec Cell,2005,18：637-650.