金属离子促进Gluconobacter oxydans高效合成2-酮基-L-古龙酸

纪凯, 刘杰, 秦苏东, 刘立明, 陈坚

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室;2.江苏江山制药有限公司,江苏靖江 214500)

金属离子促进Gluconobacter oxydans高效合成2-酮基-L-古龙酸

纪凯, 刘杰2, 秦苏东2, 刘立明＊1, 陈坚1

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室;2.江苏江山制药有限公司,江苏靖江 214500)

根据Gluconobacter oxy dans合成2-酮基-L-古龙酸(2-KL G)代谢途径采用单因素实验研究了6种金属离子对细胞生长和2-KL G的影响,在此基础上,对促进细胞生长或产酸的Mg2+、Mn2+、Fe3+建立多元二次方程模型,得到上述3种金属元素的最佳浓度为Fe3+0.21 mmol/L, Mn2+9.98 mmol/L和Mg2+4.23 mmol/L。在这一最优组合下,2-KL G产量达到65.1 g/L,与优化前比较,提高了144.4%。

Gluconobacter oxy dans;金属离子;2-酮基-L-古龙酸

维生素C是人体必需的营养元素之一,广泛应用于医药、食品、饲料及化妆品中。由国内开发的维生素C“二步工艺”是目前维生素C生产方法中应用最广和最具吸引力的工艺之一[1]。维生素C二步发酵工艺采用G.ox y dans和B.megaterium为生产菌株,催化L-山梨糖为2-酮基-L-古龙酸(2-KL G)。在这一过程中,L-山梨糖脱氢酶(SDH)和L-山梨酮脱氢酶(SNDH)是催化这一转化的关键酶。Sugisawa[2]在前期研究中发现,一定浓度的Fe3+和Mg2+和Ca2+能分别有效提高SDH和SNDH的活性,但Cu2+则抑制SNDH活性(图1)。培养基中过量的Cu2+导致发酵过程中β.megaterium自溶,从而影响G.oxy dans发酵生产2-KL G的产量[3],而添加Mg2+和Mn2+则能有效抑制这一现象[4]。

本研究在分析不同金属离子对G.ox y dans代谢途径影响的基础上,采用单因素实验考察了Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+6种金属离子对2-KL G发酵的影响,选取对细胞生长和产酸有显著影响的3种离子(Fe3+、Mg2+、Mn2+),通过建立数学模型[5-6],从而得到3种金属离子的最佳组合,促进2-KL G产量的提高。

图1 氧化葡萄糖酸杆菌中2-酮基-L-古龙酸代谢途径Fig.1 The metabolic pathway of 2-keto-L-gulonic inGluconobacter oxydans

1 材料与方法

1.1 菌种

Gluconobacteroxy dans(小菌),B acillus megaterium(大菌)。

1.2 培养基

种子培养基:L-山梨糖2.0%(单独灭菌)、牛肉膏0.3%、玉米浆0.15%、尿素0.1%、氯化钙0.1%、氯化镁0.02%、磷酸二氢钾0.1%;p H值6.7,121℃灭菌15 min。

发酵培养基:L-山梨糖8.0%(单独灭菌)、玉米浆0.2%、尿素1.0%、氯化钙0.5%、磷酸氢二钾0.1%;p H值7.0,121℃灭菌15 min。

1.3 培养方法

G.oxy dans种子培养:750 mL三角瓶装液量75 mL,吸取0.5 mL甘油管菌悬液于三角瓶中,控制初始p H值6.8,30℃,200 r/min振荡培养32 h。

B.megaterium种子培养:750 mL三角瓶装液量75 mL,吸取0.5 mL甘油管菌悬液于三角瓶中,控制初始p H 6.8,30℃,200 r/min振荡培养8～9 h。

发酵培养:750 mL三角瓶装液量75 mL,B.megaterium接种量为体积分数5%,控制初始p H 6.8～7.0,30℃,200 r/min振荡培养菌体至稳定期接入G.oxydans种子培养液,接种量为体积分数5%,继续培养72 h。每个样品做3个平行样。

1.4 分析方法

1.4.1 2-KL G浓度的测定:改进的碘量法[7]取样品2 mL于10 mL比色管中,加入2 mL 7 mol/L H2SO4,100℃条件下水浴30 min,洗入500 mL的三角瓶,加4～5滴0.1 mol/L的淀粉溶液作为指示剂,用0.1 mol/L的标准碘液滴定至蓝色为终点。2-KL G的含量(mg/mL)=7.691 6×耗碘量(mL)。1.4.2 山梨糖浓度的测定 蒽酮硫酸法[8]。

1.4.3 菌体干重测定 取10 mL发酵液于50 mL离心管中,2 200 r/min离心10 min沉淀大菌与杂质,加入1 mol/L稀盐酸洗涤沉淀两次。上清液倒入另一50 mL离心管,10 000 r/min离心20 min,倾去上清液,80℃烘干至恒重后称重。

1.5 响应面法实验设计

根据单因素实验选取对菌体生长和2-KL G产量有重要影响的3种金属离子(Fe3+、Mg2+、Mn2+),采用3因素3水平的Box-Behnken中心组合实验设计,对这3种金属离子重新编码和进行水平标注(表2)。表3列出了Box-Behnken实验设计下B.megaterium和G.ox y dans混合培养生成2-KL G的情况,其中第13-15次实验为3次重复的中心点实验,用于考察模型的误差。实验中各模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可表达为:Y=β0为响应值(2-KL G合成量),β0为常数项,βi、βij、βii为回归系数,χi、χj(i=1,4;j=1,4;i≠j)为自变量编码值。多项式模型方程拟合的性质由确定系数R2表达,其统计学上的显著性由F值检验,采用SAS典型性分析预测生物合成2-KL G的最大值以及获得最大值的条件。

2 结果与讨论

2.1 金属离子对2-KLG发酵的影响

6种金属离子(Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+)对2-KL G合成的影响如图2所示,对G.oxy dans和B.megaterium生长的影响如图3所示。与未添加金属离子的对照组比较,添加Fe3+(0.25mmol/L)、Mg2+(8.3mmol/L)、Mn2+(13.25 mmol/L)能有效地提高2-KL G的产量。当添加0.25 mmol/L Fe3+、8.3 mmol/L Mg2+、13.25 mmol/L Mn2+时,2-KL G产量提高了22.3%、39.4%、63.6%。然而,在培养基中添加一定量的Cu2+或Zn2+则明显抑制细胞生长和降低2-KL G产量。Ni2+虽然在一定程度上促进了大菌细胞生长,但2-KL G产量仅为对照组的49.4%。

图2 金属离子对G.oxydans发酵生产2-K LG的影响Fig.2 Effect of metal ions on 2-K LG production by G.oxydans

图2 金属离子对G.oxydans和B.megaterium生长的影响Fig.2 Effect of metal ions on cell growth

对细胞生长和2-KL G产量进一步分析发现: (1)与对照组比较,Mn2+或Mg2+的添加降低了单位细胞生产2-KL G的能力,且单位细胞生产2-KL G的能力随着培养基中Mn2+或Mg2+浓度的增加而逐渐下降;(2)而Fe3+的添加(0～0.25 mmol/ L)则促进了单位细胞生产2-KL G能力的提升,当培养基中Fe3+浓度为0.25 mmol/L时,单位细胞产酸量达到最大值(40.6 g/g),与对照比较,提高了35.3%。上述结果表明,Mn2+、Mg2+虽可促进细胞生长、阻止B.megaterium菌体自溶,但弱化了G.oxy dans代谢功能;而一定浓度的Fe3+则强化了G.oxy dans发酵生产2-KL G的代谢能力[2]。

2.2 金属元素影响2-KLG合成的多元二次模型方程

前期研究表明,Mn2+或Mg2+能促进细胞生长,但不促进产酸能力的提升;而添加Fe3+则能促进2-KL G的合成。结合G.oxydans中2-KL G的代谢途径(图1),优化培养基中Mn2+、Mg2+、Fe3+浓度(表1),以进一步提高2-KL G产量。上述不同金属离子浓度组合对2-KL G浓度的影响如表2所示,当培养基中Mn2+、Mg2+、Fe3+浓度分别为6.63、4.1和0.25 mmol/L(表2,实验5)时2-KL G产量达到最大值(63.9 g/L);而Mn2+、Mg2+、Fe3+浓度为13.25、12.5、0.05 mmol/L时(表2,实验4) 2-KL G产量为最小值(30.0 g/L)。对模型方程进行F值检验(表3,p<0.000 1,R2=0.992 4),表明总模型方程能解释99.24%的2-KL G浓度变化,总变异中仅0.76%不能由该模型解释,很好地反应了真实实验数据。

表1 中心组合实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box-Benhnken

表2 Box-Benhnken实验设计方案和结果Tab.2 Design and experimental results of Box-Benhnken

表3 模型回归方程方差分析Tab.3 V ariance analysis(ANOVA)for regression equation of model

对实验数据进行方程拟合并进行方差分析,结果较显著,因此可用回归方程代替实验值进行分析(表4)。采用多项式回归对实验数据进行拟合,得二次多项式方程:

2.3 2-KLG合成模型方程分析

保持培养基中Mn2+(x3)浓度为恒值,Fe3+(x1)和Mg2+(x2)对2-KL G产量的影响如图4所示;相应地,分别维持Fe3+(x1)、Mg2+(x2)恒定时,其他两种金属元素浓度变化对2-KL G产量的影响如图5和图6所示。在等高线图中,极值条件需出现在圆心处。分析图3-图5发现,Fe3+与Mn2+的交互影响最为显著,表现为等高曲线陡峭,Fe3+与Mg2+次之,而Mg2+与Mn2+的交互影响最弱,表现为等高曲线较为平滑。这一结果说明Fe3+对2-KL G产量影响最大,而Mg2+与Mn2+则相对较小。

2.4 促进2-KLG合成的最佳金属元素组合

由于模型方程(2)中x1、x2、x3的二次项系数为负,抛物线开口向下,因此方程有最大值(65.10 g/ L)。采用SAS软件对方程进行岭脊分析,得到上述3个显著因素的最优组合:Fe3+0.21 mmol/L、Mn2+9.98 mmol/L和Mg2+4.23 mmol/L。以上述最优的金属元素组合进行实验,2-KL G产量分别达到65.0 g/L、65.2 g/L和65.1g/L,3次重复实验的平均值为65.1 g/L,接近预测值。表明模型方程真实可行,很好地预测了实验结果。

表4 模型回归系数显著性检验和结果Tab.4 Significance test and results for regression coefficients of model

图4 Y=f(x1,x2)的响应面和等高线图Fig.4 Responsive surfaces and contour ofY=f(x1,x2)

图5 Y=f(x2,x3)的响应面和等高线图Fig.5 Responsive surfaces and contour ofY=f(x2,x3)

图6 Y=f(x1,x3)的响应面和等高线图Fig.6 Responsive surfaces and contour ofY=f(x1,x3)

3 结 论

在分析金属离子G.oxydans合成2-KL G代谢途径的基础上,采用单因素实验分析了Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+6种金属离子对细胞生长和2-KL G合成的影响,发现仅Fe3+、Mn2+和Mg2+能促进细胞生长或产酸。在此基础上,以2-KL G产量为目标函数,建立二次多项式数学模型,寻求培养基中Fe3+、Mg2+、Mn2+最佳浓度。发现当Fe3+、Mg2+、Mn2+浓度分别为0.21 mmol/L、4.23 mmol/L和9.98 mmol/L时,2-KL G产量达到65.1 g/L,与优化前比较,提高了144.4%。

[1]冯树,张忠泽.维生素C生物发酵[J].微生物学杂志,1999,19(2):45-51.

FENG Shu,ZHANG Zhong-ze.Microbial fermentation of vitamin C[J].J Microbiol,1999,19(2):45-51.

[2]Sugisawa T,Hoshino T,Setsuko N,et al.Isolating and characterization of memebrance-bound L-sorbose dehydrogenase from Gluconobacter melanogenus UV 10[J].Agri Biol Chem,1991,55(2):363-370.

[3]李国才,张忠泽.2-KL G产生菌混合发酵特性及最佳混生模式的研究[J].微生物学杂志,1997,17(2):1-4.

LI Guo-cai,ZHANG Zhong-ze.Study on characteristics of mixed fermentation of 2-KL Gproducing strains and their mixed growth pattern[J].J Microbiol,1997,17(2):1-4.

[4]Svarachorn A.Autolysis of Bacillus subtilis induced by monovalent cations[J].Appl Microbio Biotechnol,1989,60(3): 299-304.

[5]Ooijkaas L P,Wilkinson E C,Tramper J,et al.Medium optimization for spore production of Coniothyrium minitans using statistically-based experimental designs[J].Biotechnol Bioeng,1999,64:92-100.

[6]Ismail A,Soultani S,Ghoul M.Optimizatin of the enzymatic synthesis of butyl glucoside using response surface methodology[J].Biotehnol Progr,1998,14:874-878.

[7]朱可丽,张海宏,孙传宝,等.维生素C二步发酵混菌接种控制[J].微生物学杂志,1998,18(2):13-15.

ZHU Ke-li,ZHANG Hai-hong,Sun Chuan-bao,et al.Studies on inoculation in the two-step fermentation of vitamin C [J].J Microbiol,1998,18(2):13-15.

[8]尹光琳,何建明,任双喜,等.新组合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖发酵产生维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸的研究I.新组合菌系SCB329-SCB933的生物学特性[J].工业微生物,1997,24(1):1-7.

YIN Guang-lin,HEJian-min,REN Shuang-xi,et al.Production of vitamin C precursor 2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose bu a novel bacterial component system of SCB329-SCB933 I.The biological characteristics of a novel bacterial component system of SCB329-SCB933[J].Industrial Microorganism,1997,24(1):1-7.

(责任编辑:杨萌)

Enhancement of 2-keto-L-gulonic production in Gluconobacter oxydansThrough Feeding Metalions

J I Kai1, LIU Jie2, QING Su-dong, ,LIU Li-ming＊1,CHEN Jian1,2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;
2.Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co.,Ltd.Jingjiang 214500,China)

To further increase the production of 2-keto-L-gulonic acid byGluconobacter oxy dans,the effects of six different metal ions were determined,based on the analysis of L-Sorbosone pathway.It was found thatFe3+,Mg2+,Mn2+can enhance the cell growth and 2-KL G production.Then,an optimum concentration of those three metal ions was achieved by developing a multivariate quadratic equation:Fe3+0.21 mmol/L,Mn2+9.98 mmol/L,and Mg2+4.23 mmol/L.By using the optimum combination,the production of 2-keto-L-gulonic reached at 65.1 g/L,which is 144.4%higher than that of the control.

Gluconobacter oxy dans,metal ions,2-keto-L-gulonic

S 567

:A

1673-1689(2010)01-0139-06

2008-07-10

国家863计划项目(2006AA020303);国家“十一五”科技支撑计划项目(2007BAI46B02)。

＊通讯作者:刘立明(1976-),男,安徽宿松人,工学博士,副教授,主要从事微生物细胞生理功能工程研究。Email:mingll@jiangnan.edu.cn