棕点石斑鱼胚胎发育的观察

林 彬，黄宗文，骆 剑，郭仁湘，杨 薇，陈国华

（海南大学海洋学院 热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口 570228）

棕点石斑鱼胚胎发育的观察

林 彬，黄宗文，骆 剑*，郭仁湘，杨 薇，陈国华

（海南大学海洋学院 热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口 570228）

在观察了自然产卵的棕点石斑鱼胚胎发育过程的基础上，依据各个发育阶段的形态变化特征制订了系统的分期标准.棕点石斑鱼胚胎发育可划分为受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官发生和孵化6个阶段，共23个时期.比较同属其他石斑鱼的胚胎发育发现：不同种石斑鱼胚胎发育速率的差别可能与物种成鱼大小的差别存在一定的联系；石斑鱼卵子油球的状况可能作为卵子质量的参考.此外，养殖条件下棕点石斑鱼自然产卵有较强的规律性，这对其人工繁育和育苗有非常好的帮助.

棕点石斑鱼；自然产卵；胚胎发育

自1966年鹈川正雄［1］等人首次报道了赤点石斑鱼的产卵行为以后，国内外对各种石斑鱼的人工繁殖和养殖研究工作相继展开.我国自20世纪70年代开始研究石斑鱼人工繁殖技术，已取得了青石斑鱼（E.awoara）、赤点石斑鱼（E.akaara）、斜带石斑鱼（E.coioides）、点带石斑鱼（E.malabaricus），鞍带石斑鱼（E.lanceolatus）等10余种石斑鱼人工繁殖的成功［2］.其中关于石斑鱼的胚胎发育及胚后发育的研究工作为石斑鱼人工繁育技术的发展提供了第一手的参考资料［3-8］，推动了我国石斑鱼产业化的发展.

棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）俗称老虎斑，隶属鲈形目（Perciformes）鲈亚目（Percoidei）鮨科（Serranidae）石斑鱼属（Epinephalus）.由于其营养丰富、味道鲜美，已成为南方4省石斑鱼产业中的重要品种.目前棕点石斑鱼的人工繁殖已经取得了突破［9］，然而其受精率和孵化率非常不稳定，导致苗种的供给无法适应市场的需求变化.针对此问题，笔者系统观察了棕点石斑鱼胚胎发育的过程，并依据其形态结构特征制定了分期标准.一方面可为解决人工繁育中孵化环节中存在的问题提供参考，另一方面棕点石斑鱼胚胎发育的资料在比较胚胎学上也具有一定的研究价值.

1 材料与方法

1.1 亲鱼来源

实验亲鱼为海南省青利水产有限公司在陵水新村港养殖渔排所蓄养的4～5龄棕点石斑鱼，产卵前对网箱中的亲鱼进行强化培育.在海南省陵水海域，棕点石斑鱼亲鱼产卵季节为4～11月，产卵日期一般在每月的18～23日.

1.2 产卵地点和时间

产卵及胚胎发育观察的地点为陵水县新村港养殖渔排，2009年10月18～21日.

1.3 设备和工具

主要的实验设备和工具为ALPHA PHOT-2 YS2显微镜、Nikon COOLPIX P5100数码相机、充气泵和普通捞卵工具等.

1.4 胚胎发育观察记录方法

棕点石斑鱼产卵时间一般为22：00点至次日1：00，在此时间段每隔10 min用80目手抄网在产卵网箱中打捞检查.发现受精卵后，立即记录该时间为产卵时间并实时测量水温及海水盐度.在胚胎发育早期的受精卵至原肠期，每10 min在显微镜下观察记录1次，每次记录10枚胚胎；胚体期至孵化期每30 min观察记录1次，每次记录20～30枚胚胎.胚胎发育各时期时间点的确认以镜检约50％的胚胎出现相应分期特征为标准；各发育时期的划分参考硬骨鱼类的胚胎发育分期方法［10］.

2 结果

2.1 产卵时间

2009年10月19日，23：30打捞到受精卵，立即镜检发现个别受精卵开始第一次卵裂，大多数处于未分裂状态.

亲鱼产卵结束后，在产卵网箱中共收集到800 g受精卵，经过静置沉淀，上层浮卵为305 g，受精率为38.1％.

2.2 胚胎发育的特征和时间的划分

棕点石斑鱼受精卵在水温26.5～28.0℃，盐度30～32的海水中培育，历经22 h完成整个胚胎发育过程，进入胚后发育.棕点石斑鱼发育过程见表1.

2.2.1 受精卵

棕点石斑鱼的受精卵为硬骨鱼类端黄卵，圆形透明呈浮性，卵径为0.820±0.015 mm，卵的中央有一直径约0.235±0.010 mm的大油球（见图版1-1）.受精后约20 min，由皮层的细胞质发生向动物极集中形成一个盘状隆起，即为胚盘隆起.

2.2.2 卵裂期

棕点石斑鱼的卵裂方式为盘状卵裂.受精后26 min出现第1次卵裂，为经裂，将胚盘分割成2个大小均等的细胞（见图版1-2）；受精后约30 min进行第2次分裂，分裂面与第一个卵裂面垂直，成十字状把胚盘分裂成4个均等细胞，进入4细胞期（见图版1-3）；受精42 min后，完成第3次卵裂，形成8个细胞.此次卵裂有2个分裂面，都与第一次平行，结果形成2排，每排4个细胞的胚盘（见图版1-4）；受精后55 min，完成第4次卵裂，此次卵裂也有2个分裂面，与第2次平行，结果形成4排，每排为4个分裂球的16细胞（见图版1-5）；受精后1 h16 min，完成第5次卵裂，此次卵裂为纬裂，形成32个细胞（见图版1-6）.从这次分裂起，分裂面切割细胞的速度开始出现差异，从肉眼观察已较难分辨是垂直分裂还是平行分裂，受精后大约1 h30 min，完成第6次分裂，形成64个细胞（见图版1-7）.卵裂球细胞的排列很不规则，且大小不一，细胞之间的界线也难以分辨.此后细胞开始出现层叠现象；受精后1 h55 min，可观察到细胞成不规则方形，大小不均等，细胞明显变小，此时无法对其进行计数，胚胎进入多细胞期（见图版1-8）.随着分裂进行，细胞进一步变小，受精后约2 h15 min，与桑椹球形状非常相似，此时进入桑椹胚期（见图版1-9）.

2.2.3 囊胚期

受精后2 h50 min，细胞数目的不断增加与堆积，胚盘与卵黄之间形成囊胚腔，囊胚中间明显向上隆起成高帽状，此时进入高囊胚期（见图版1-10）；受精后4 h15 min，由隆起的高帽状逐渐变低，囊胚变的扁平，细胞进一步变小变多，此时进入低囊胚期（见图版1-11）.

表1 棕点石斑鱼胚胎发育分期Tab 1 Different periods of embryonic development of Epinephelus fuscoguttatus

2.2.4 原肠期

在囊胚阶段后期，囊胚边缘的细胞增多，这些边缘的细胞开始沿卵黄外围向植物极方向迁移、延伸和下包，逐渐将卵黄囊包裹其中.囊胚细胞在赤道面附近某一位置发生内卷，胚胎进入原肠期.棕点石斑鱼原肠胚期可分为原肠早期、原肠中期和原肠晚期3个发育阶段.受精后4 h53 min，边缘细胞增多增厚，缓慢运动并向内卷，卵黄被胚层下包了约1/2，此时进入原肠早期（见图版1-12）.侧面观胚盾开始显现；受精后5 h37 min，胚层下包卵黄囊3/4，进入原肠中期（见图版1-13），胚盾拉长；受精后6 h32 min，进入原肠晚期（见图版1-14），胚层下包卵黄几乎将卵黄囊全部包裹.

2.2.5 神经胚期

原肠运动完成后胚胎背部增厚.受精后8 h20 min，胚层下包收缩成小圆孔，即胚孔.背部形成一条神经索，标志着进入神经胚期（见图版1-15），胚体的轮廓初现.

2.2.6 视泡形成期

从神经胚晚期开始，胚胎的主要器官陆续出现.在受精后9 h35 min，胚胎头部明显增大，头部两侧出现1对视泡，出现2对肌节，此时为视泡形成期（见图版1-16）.

2.2.7 听囊形成期

受精后10 h36 min，器官继续分化，听囊形成（见图版1-17），在头部后方左右两侧出现1对听囊，呈椭圆形.此时头和尾已可以清楚分辨，胚胎拥有6对肌节.

2.2.8 晶体形成期

在受精后13 h32 min，进入晶体形成期（见图版1-18），此时视泡内的晶体轮廓清晰，胚体肌节8～10对.本文未将脑泡的形成划分为单独一个时期，是因为按照脊椎动物胚胎学的规律［9］，在视泡出现之时，脑泡的形态已存在，在听囊、晶体形成之时膨大的脑泡是由于脑室的扩大和分化造成的.

2.2.9 心脏形成期

受精后14 h30 min，胚体头部的下方的胸腔逐渐膨大，心脏部位可见团状隆起，心脏开始形成.同时肌节增加到16～18对（见图版1-19）.

2.2.10 肌肉效应期

胚胎持续发育，头部逐渐膨大，晶状体、听囊等更加清晰，可见离开卵面的尾芽，油球移到卵黄囊的后端.受精后大约18 h30 min，胚胎出现颤动，此时为肌肉效应期（见图版1-20）.

2.2.11 心跳期

受精后20 h46 min，尾芽继续延长，听囊内可见一对耳石，心脏开始轻微跳动，胚体颤动频率加快，此为心跳期（见图版1-21）.

2.2.12 孵化期

随着胚体的继续发育，在受精后21 h15 min，心跳加快，胚体头部破膜先孵出，然后尾部不断摆动，继而完全脱去卵膜，此时期为出膜孵化期（见图版1-22），再经过大约50 min的发育时间，大部分仔鱼孵出，刚孵出的仔鱼全身透明，全长约为1.81± 0.12 mm，带有一个大的椭圆形卵黄囊（见图版1-23）.

初孵的仔鱼卵黄囊朝下，悬浮于水中，头部两侧各有3支羽状外鳃丝，尾部偶尔摆动，无游泳能力.在水温27±1℃，盐度31±1的海水中，棕点石斑鱼从受精卵到孵化出膜，整个胚胎发育过程历时22 h.

3 讨论

棕点石斑鱼胚胎发育经历卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官发生和孵化等6个阶段，根据其形态变化特征可划分为23个时期.其胚胎发育符合硬骨鱼类胚胎发生的一般规律［10］，主要的差别在于棕点石斑鱼的初孵仔鱼头部两侧各有3支羽状外鳃丝，而其他有关石斑鱼胚胎发育的报道很少见此特征的描述.其他方面与常见的石斑鱼的胚胎发育过程［3-8］大体相似.

一般而言，同种鱼类卵子在相同温度条件下，卵子的大小对发育速率的影响不显著.而就不同种鱼类而言，所产的卵子越大其发育速率通常越慢［11］.棕点石斑鱼受精卵的卵径为0.820±0.015 mm，同属的鞍带石斑鱼卵径为0.85±0.02 mm［7］，斜带石斑鱼为0.78±0.16 mm［5］、点带石斑鱼为0.75～0.77 mm［6］，赤点石斑鱼为0.7～0.8 mm［4］.这几种石斑鱼的卵子大小没有明显差别，然而其胚胎发育所需要的时间却存在着差异.鞍带石斑鱼在水温27±0.5℃的海水中，历时约26 h完成胚胎发育［7］；点带石斑鱼在24.9～27.6℃的温度下历时21 h完成胚胎发育［6］；赤点石斑鱼的这一数据是18 h（27.9～29.3℃）［4］，本研究中棕点石斑鱼胚胎发育历时22 h（27±1℃）.对比这几种石斑鱼的胚胎发育时间数据不难发现，成鱼体型最大的鞍带石斑鱼胚胎发育需要的时间最长，而成鱼体型相对较小赤点石斑鱼胚胎发育时间最短，其他种类的差异不明显，处于居中位置.这暗示着不同种的胚胎发育时间长短与物种成体的个体大小可能存在一定的联系.

油球（或称脂肪球）是石斑鱼卵子通常拥有的构造.关于油球的作用，以往认为油球对海水鱼卵的浮性起主要作用，现已证实鱼类卵子的浮性主要取决于卵黄内水分的含量，而油球仅是营养物质存在的一种形式［11］.在各种石斑鱼人工繁殖育苗工作中均有发现，油球的存在形式通常有一个或多个.未成熟或卵质不佳的卵子通常拥有10余个小油球［12］，这样的卵子受精率孵化率非常低，幼苗畸形率高.此次棕点石斑鱼胚胎实验采用的是自然产卵的卵子，几乎没有发现多个油球的情况.在非人工授精的情况下，受精率达到了38％，畸形幼苗也非常稀少，这说明油球的状况应该可能作为判断石斑鱼卵子质量的一个参考.

在人工养殖条件下，多数种类的石斑鱼都很难自然产卵受精［13-14］.如鞍带石斑鱼在人工条件下自然产卵难以受精，催产的成功率也不高［7］.巨石斑鱼、桔点石斑鱼、云纹石斑鱼、赤点石斑鱼以及美洲黑石斑鱼［13-15］等有过自行产卵的记录，但产卵量和规律均难以预测.点带石斑鱼在人工养殖条件下，通过强化培育能够自然产卵，产卵量大卵子质量较好［6］.棕点石斑鱼在海南海湾渔排养殖条件下，每年4～11月，会在固定的日期自行产卵，规律性较强，这是其人工繁殖的优势条件.通过加强棕点石斑鱼的亲鱼培育，提高其卵子的质量和稳定性，改进孵化和育苗技术等，可望提高育苗的稳定性，扩大苗种规模，推进棕点石斑鱼产业的发展.

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责任编辑：黄 澜

Embryonic Development Observation of Epinephelus Fuscoguttatus

LIN Bin，HUANG Zongwen，LUO Jian*，GUO Renxiang，YANG Wei，CHEN Guohua
（College of Ocean，Hainan University；Key Laboratory of Tropic Biological Resources of Ministry of Education，Haikou 570228，China）

The embryos of Epinephelus fuscoguttatus collected by natural spawning are observed in detail.Based on the external morphological features，six periods including 23 stages of Epinephelus fuscoguttatus embryo are established，which are cleavage period，blastula period，gastrula period，neural period，organogenesis period and hatching period.The features of embryo development are consistent with those fishes of Epinephelus akaara，Epinephelus malabaricus and Epinephelus lanceolatus.The result indicates that the different of embryonic development rate in these groupers have some possible connections with its natural species size.For example，the embryonic development time of E.lanceolatus，a huge grouper，is longer than small groper E.akaara.The status of oil globule may be an evidence of eggs quality in groupers artificial propagation.Moreover，the self-acting spawning of E.fuscoguttatus，in culture condition，shows the preferable regularity.It's helpful to artificial propagation and larva.

Epinephelus fuscoguttatus；Natural spawning；Embryonic development

Q 132

A

1674-4942（2010）01-0087-06

2009-11-11

国家科技支撑计划项目（2007BAD29B01）；海南大学重点科研项目（hd09xm11）

*通讯作者