补肾化痰中药对烟熏大鼠慢支模型气管和肺组织AR表达的影响*

蒋士卿，王淑玲，闫爱华

(1.河南中医学院，河南 郑州 45000;2.郑州大学基础医学院，河南 郑州 450052)

补肾化痰中药对烟熏大鼠慢支模型气管和肺组织AR表达的影响*

蒋士卿1，王淑玲2，闫爱华2

(1.河南中医学院，河南 郑州 45000;2.郑州大学基础医学院，河南 郑州 450052)

目的:通过观察补肾化痰中药对烟熏大鼠慢支模型气管和肺组织中AR表达的影响，探讨补肾化痰中药防治慢支的作用机理。方法:将健康雄性Wistar大鼠72只随机均分为正常对照组、慢支模型组、气管炎咳嗽痰喘丸组、补肾化痰大剂量组、补肾化痰小剂量组和自然恢复组，每组12只，采用香烟烟雾吸入法建立雄性大鼠慢支模型，在模型复制成功后分别灌胃给药补肾化痰中药和气管炎咳嗽痰喘丸，治疗时间为30d，采用免疫组化SP法检测各组大鼠气管和肺组织中雄激素受体(AR)的表达，采用放免法测定各组大鼠血清睾酮(T)的含量。结果:与正常对照组比较，慢支模型组和自然恢复组大鼠气管和肺内支气管AR的表达水平均明显升高(P<0.01，P<0.05)，血清T水平明显下降(P<0.01);与慢支模型组比较，补肾化痰大、小剂量组和气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠气管和肺内支气管中AR表达水平显著降低(P<0.01，P<0.05，P<0.001)，血清 T水平明显升高(P<0.05)。结论:补肾化痰中药能使烟熏雄性大鼠慢支模型的气管和肺组织中AR的高水平表达降低，血清低水平T含量升高，提示补肾化痰中药调节雄激素及其受体水平可能是其治疗慢支的作用机理之一。

雄性大鼠;慢性支气管炎;补肾化痰中药;气管炎咳嗽痰喘丸;雄激素受体(AR)、睾酮(T)、香烟烟雾吸入;免疫组化

本研究采用香烟烟雾吸入法建立雄性大鼠慢支模型，采用免疫组织化学SP法检测大鼠气管和肺组织中雄激素受体(AR)的相对含量，探讨补肾化痰中药对雄性慢支大鼠气管和肺组织中AR表达的影响，为研究补肾化痰中药防治慢支的作用机制积累资料。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康雄性Wistar大鼠72只，体重180g～220g，由河南省实验动物中心提供。随机分为正常对照组、慢支模型组、气管炎咳嗽痰喘丸组、补肾化痰大剂量组、补肾化痰小剂量组和自然恢复组6组。

1.2 药物与主要试剂

补肾化痰中药由何首乌、淫羊藿、蛇床子、五味子、菟丝子、覆盆子、款冬花、紫菀组成，水煎浓缩至每毫升相当于含生药1.5g;气管炎咳嗽痰喘丸为中国北京同仁堂集团公司产品，批号1080032，使用时用蒸馏水配制成每毫升含药物0.105g的混悬液。“鸿禧”牌84mm烤烟型香烟由河南汝州卷烟厂生产，焦油量17mg，烟气烟碱量1.1mg。抗大鼠AR第一抗体为抗AR羧基端多肽片段的亲和纯化兔多克隆抗体为Santa Cruz产品;SP系列工作液试剂盒及DAB试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品;睾酮(T)放免试剂盒(包被管法)为天津德普生物技术和医学产品有限公司产品。

1.3 慢性支气管炎模型的建立

参照文献方法并进行改良采用香烟烟雾吸入法建立大鼠慢性支气管炎模型。自制1个1740mm×1100mm×1500mm的烟熏箱，顶部对角留两个2mm×3mm的通气孔，将除正常对照组以外的其余5组大鼠分别装于自制的钢丝笼内，每笼6只，放置于烟熏箱中的架子上，香烟每份4支，用铁丝捆扎，点燃后分别悬挂于钢丝笼下，15min后点燃第二批香烟，共用香烟64支。每次50min，每天2次，38d后改为每天1次，每次50min，用烟量同前，共计76d。

1.4 动物处理及组织切片的制作

慢支模型组于烟熏76d后的当天上午氯胺酮麻醉，腹主动脉抽血，离心分离血清，分装后 －20℃保存待测，小心剖取气管和肺，剪取右肺的一叶和气管放入4%的中性甲醛固定液中;补肾化痰中药组与气管炎咳嗽痰喘丸组均采用治疗给药，在停止烟熏的当天，气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠灌胃气管炎咳嗽痰喘丸药物混悬液(每毫升含药物0.105g，相当于成人常规临床用量的10倍);补肾化痰小剂量组将补肾化痰中药浓缩液稀释至每毫升含生药0.75g灌胃(相当于成人常规临床用量的5倍);补肾化痰大剂量组直接灌胃补肾化痰中药浓缩液(每毫升含生药1.5g，相当于成人临床常规用量的10倍);自然恢复组给予蒸馏水灌胃;正常对照组不进行烟熏，仅从第76天开始灌胃蒸馏水，每天灌胃1次，连续30d，在灌胃结束后的第2天处死全部大鼠，处死方法和标本收集与慢支模型组相同。

从固定液中取出标本，修块，乙醇梯度脱水，低熔点石蜡包埋，3μm～4μm切片，用铬矾明胶处理过的载玻片直接上片。

1.5 AR免疫组化染色及结果判断

各组大鼠气管和肺组织的AR免疫组化染色步骤按照试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗作为阴性对照，以大鼠睾丸组织标本作为阳性对照，以细胞浆或细胞核内出现明显棕黄色颗粒为阳性表达。并用高清晰度病理图文分析系统测定AR阳性细胞的平均灰度和平均光度。

1.6 血清睾酮(T)含量测定

采用SN-695型智能放免γ测量仪检测各组大鼠血清睾酮(T)水平，操作方法按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠气管中雄激素受体(AR)的表达

表1显示，与正常对照组(图1)比较，慢支模型组大鼠(图2)和自然恢复组大鼠气管中AR的表达(图3)均明显增强(P<0.01);补肾化痰大剂量组气管中AR的表达(图4)略强于正常对照组，其差异无统计学意义(P>0.05);自然恢复组大鼠 AR相对含量低于正常对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。与慢支模型组比较，补肾化痰大剂量组和小剂量组大鼠气管AR的表达(图5)明显减弱(P<0.01)，气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠气管中AR的表达(图6)减弱最显著(P<0.001);自然恢复组大鼠气管中AR的表达虽略有减弱，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 雄激素受体(AR)在各组大鼠气管中的表达(±s)

表1 雄激素受体(AR)在各组大鼠气管中的表达(±s)

注:与慢支模型组比较: P<0.01， P<0.001;与正常对照组比较:△△P<0.01

组别 n 平均灰度 平均光度正 常 对 照 组 12 99.9± 7.75 0.293±0.05 慢 支 模 型 组 12 87.0± 9.60△△ 0.358±0.06△△气管炎咳嗽痰喘丸组 12 106.7±11.29 0.265±0.04 补肾化痰大剂量组 12 102.8±12.17 0.289±0.06 补肾化痰小剂量组 12 103.2±12.28 0.293±0.05 自 然 恢 复 组 12 90.6± 6.28△△ 0.346±0.03△△

2.2 各组大鼠肺组织中雄激素受体(AR)表达

表2显示，与正常对照组(图7)比较，慢支模型组大鼠(图8)和自然恢复组大鼠肺组织中AR的表达(图9)均明显增强(P<0.05)，补肾化痰大剂量组(图10)和补肾化痰小剂量组大鼠肺组织中 AR的表达(图11)略强于正常对照组，但无统计学意义(P>0.05);气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠肺组织中AR的表达(图12)低于正常对照组，但差异也无统计学意义(P>0.05);与慢支模型组比较，补肾化痰大剂量组和小剂量组大鼠肺组织AR的表达明显减弱(P<0.05或 P<0.01)，以气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠肺组织中 AR的表达减弱最显著(P<0.01)。用PBS代替一抗的大鼠气管(图13)和肺组织(图14)均无阳性细胞出现。

图1 AR在正常对照组大鼠气管的表达免疫组化(×200)

图2 AR在慢支模型组大鼠气管的表达免疫组化(×200)

图3 AR在自然恢复组大鼠气管的表达免疫组化(×200)

图4 AR在补肾化痰大剂量组大鼠气管的表达免疫组化(×200)

图5 AR在补肾化痰小剂量组大鼠气管的表达，免疫组化(×200)

图6 AR在气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠气管的表达，免疫组化(×200)

表2 雄激素受体(AR)在各组大鼠肺组织中的表达(±s)

表2 雄激素受体(AR)在各组大鼠肺组织中的表达(±s)

注:与慢支模型组比较:*P<0.05， P<0.01， P<0.001;与正常对照组比较:△P<0.05，△△P<0.01

组别 n 平均灰度 平均光度正 常 对 照 组 12 140.5± 6.04* 0.114±0.015 慢 支 模 型 组 12 134.4± 5.92△ 0.143±0.023△△气管炎咳嗽痰喘丸组 12 149.9±15.21 0.092±0.034 补肾化痰大剂量组 12 142.2± 9.25* 0.117±0.029*补肾化痰小剂量组 12 143.2± 7.93 0.124±0.016*自 然 恢 复 组 12 135.1± 5.29△ 0.139±0.017△△

图7 AR在正常对照组大鼠肺内支气管的表达，免疫组化(×200)

图8 AR在慢支模型组大鼠肺内支气管的表达免疫组化(×200)

图9 AR在自然恢复组大鼠肺内支气管的表达，免疫组化(×200)

图10 AR在补肾化痰大剂量组大鼠肺内支气管的表达，免疫组化(×200)

图11 AR在在补肾化痰小剂量组大鼠肺内支气管的表达，免疫组化(×200)

图12 AR在在气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠肺内支气管的表达，免疫组化(×200)

图13 用PBS代替一抗，慢支模型组大鼠气管中未见AR阳性细胞(阴性对照)，免疫组化(×200)

图14 用PBS代替一抗，慢支模型组大鼠肺内支气管中未见AR阳性细胞(阴性对照)免疫组化(×200)

2.3 各组大鼠血清睾酮(T)水平

表3显示，与正常对照组比较，慢支模型组和自然恢复组大鼠血清T水平显著下降(P<0.01);与慢支模型组比较，补肾化痰大、小剂量组和气管炎咳嗽痰喘丸组大鼠血清T水平均明显升高(P<0.05)，以补肾化痰大剂量组升高幅度最大，自然恢复组大鼠血清T水平虽有上升的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠血清睾酮(T)水平(±s)

表3 各组大鼠血清睾酮(T)水平(±s)

注:与慢支模型组比较:*P<0.05， P<0.01;与正常对照组比较:△△P<0.01

组别n T(nmol/L)正 常 对 照 组 12 4.86±2.29 慢 支 模 型 组 12 2.16±1.12△△气管炎咳嗽痰喘丸组 12 3.30±1.15*补肾化痰大剂量组 12 3.55±1.44*补肾化痰小剂量组 12 3.44±0.96*自 然 恢 复 组 12 2.37±0.97△△

3 讨论

近年来，从下丘脑-垂体-性腺轴探讨呼吸系统疾病发病机制的研究报道逐渐增多，慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清睾酮(T)水平明显低于正常人;也有研究发现，在正常雄性大鼠的气管和肺组织中存在雄激素受体(AR)的表达，推测老年人体内雄激素水平降低，通过AR直接影响气管和肺组织，导致气管和肺功能减退，可能是老年人慢支发病率显著高于青年人的主要原因，并且认为雄激素及其受体可能是中医学“肺肾相关”的物质基础之一。本研究观察了补肾化痰中药对烟熏慢支雄性大鼠气管和肺组织中AR表达的影响，对于探讨从“肾”论治慢支的机理有重要意义。

研究结果显示，烟熏大鼠慢支模型气管和肺组织中AR的表达明显强于正常对照组，血清T水平明显低于正常对照组。雄激素对AR的调节作用有的为升调节，有的为降调节，因此低水平的雄激素也可能导致AR的高表达。但我们在小鼠的研究中发现，此时睾丸中的AR mRNA表达量是降低的，说明血清雄激素水平的降低并不是导致气管、肺组织中AR高表达的主要原因。由于香烟烟雾吸入引起气管中AR高表达的升高程度高于肺组织，由此可以推测，气管和肺组织中AR的高表达可能主要与香烟中有害物质的直接刺激有关。梁澍等报道，肺癌患者癌组织中AR阳性表达率为61.7%，且AR在肺鳞癌的阳性表达率明显高于肺腺癌。韩勇等研究显示，患慢性支气管炎、肺气肿病史的 COPD患者，肺癌发生的危险性明显增高(P<0.05)，因此气管、肺组织中AR的高表达是否为香烟诱发肺癌的原因之一，值得进一步研究。

自然恢复组大鼠气管和肺组织中AR的表达量及血清T水平与慢支模型组比较均无显著性差异，这可能与停止香烟烟雾吸入的时间较短(30d)有关，提示长期吸烟即使戒烟也不能在短时间内完全恢复正常。

补肾化痰中药是由五子衍宗丸加化痰药加减而成，五子衍宗液内服可使老年(60岁 ～80岁)肾虚衰老症状的总积分值下降，血浆睾酮(T)含量上升，雌二醇(E2)与T比值下降。本研究显示，由五子衍宗丸化裁而来的补肾化痰中药能使烟熏大鼠慢支模型已经出现的气管、肺组织中AR的高水平表达显著降低，血清T水平明显升高，推测补肾化痰中药通过调节雄激素及其受体的表达水平可能是其治疗慢支的作用机制之一，同时也提示戒烟后加用补肾化痰中药能促进其修复，但补肾化痰中药影响气管及肺组织AR表达量的具体途径仍不清楚。

总之，烟熏大鼠慢支模型伴有气管、肺组织中AR的异常表达，补肾化痰中药对AR的异常变化有一定治疗作用。但AR的异常变化在呼吸系统疾病发病中的作用如何?香烟烟雾通过哪些途径影响AR的表达?补肾化痰中药通过哪些环节调节AR的表达等等，均有待进一步研究。

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0772-03

河南省杰出青年科学基金资助项目(04120001000)

2010-01-26