宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中Survivin与Bcl-2的表达及相关性

朱华，施铮铮，张虎祥，万丽，杨孝军，郑飞云

(温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000，1.妇产科；2.病理科)

凋亡抑制和增殖能力增强是肿瘤发生的两大主要机制。存活素（Survivin）是新近发现的一种凋亡抑制基因，它是凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP）家族中结构最简单的蛋白分子，也是至今发现抗凋亡作用最强的基因。Survivin基因在正常组织中不表达，而在几乎所有被研究的肿瘤组织中呈阳性表达[1]，这一特点为肿瘤的诊断和治疗提供了新的靶点。本研究采用原位杂交法检测Survivin在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变（CIN）中的表达，采用免疫组化法检测Bcl-2蛋白的表达，探讨两者在宫颈癌发生、发展中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料 宫颈浸润癌81例，CIN 74例，以同期20例正常宫颈组织作对照。均为取自本院2006年1月-2008年3月间经病理证实的临床资料较完整的宫颈标本。患者年龄19～78岁，平均（40.1±11.2）岁。取材前未接受任何其他治疗。所有标本及时以4%多聚甲醛(含有1/1000 DEPC)固定，石蜡包埋，4μm连续切片。

1.2 临床分期、病理分型及病理分级 74例CIN中包括CINI级13例，CINII级26例，CINIII级35例。81例宫颈浸润癌中包括70例鳞癌和11例腺癌，根据1970年再次修订的FLGO临床分期标准，分为Ia期9例，Ib期17例，IIa期33例，IIb期12例，III期10例；按组织病理学分级分为高分化14例，中分化29例，低分化38例；按照肿瘤生长类型分为外生型39例，内生型15例，溃疡型16例，颈管型11例。81例宫颈癌患者中54例行广泛性子宫切除术＋盆腔淋巴结清扫术（包括Ia期3例、Ib期17例、IIa期33例、IIb期1例），有淋巴结转移者33例，无转移21例。

1.3 主要试剂 鼠抗人Bcl-2多克隆抗体和免疫组化试剂盒（即用型二步法）购自北京中杉生物技术公司。Survivin原位杂交检测试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司，针对人Survivin靶基因的mRNA引物序列为：①5’-CCTGG CAGCC CTTTC TCAAG GACCA CCGCA-3’；② 5’-AAGCA TTCGT CCGGT TGCGC TTTCC TTTCT-3’；③ 5’-AGAAA GTGCG CCGTG CCATC GAGCA GCTGG-3’。

1.4 测定方法

1.4.1 原位杂交法检测Survivin mRNA表达：地高辛标记的Survivin mRNA寡核苷酸探针检测石蜡包埋组织的Survivin mRNA序列：切片脱蜡，0.5% H2O2室温处理30 min，加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化，暴露Survivin mRNA核酸片段，滴加预杂交液，42 ℃恒温4 h，滴加杂交液，42 ℃恒温箱过夜，梯度SSC洗涤，依次滴加封闭液，生物素化鼠抗地高辛，SABC，DAB显色，复染，透明，封片镜检。以不加Survivin探针只加预杂交液作为阴性对照。

1.4.2 免疫组织化学法检测Bcl-2蛋白表达：按常规免疫组化试剂盒即用型二步法操作步骤进行。组织切片脱蜡，微波修复抗原，3% H2O2阻断剂孵育10 min，PBS液冲洗。加入1:50 Bcl-2鼠抗人单克隆抗体，4 ℃冰箱过夜。PBS冲洗，加入即用型二抗PV-6000，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，透明，封片镜检。用PBS液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性的乳腺癌作阳性对照。所有切片均在相同条件下进行。

1.5 结果评价标准 Survivin和Bcl-2阳性表现为细胞浆中出现淡黄色至棕黄色颗粒。随机观察10个高倍镜视野，按每高倍镜视野阳性细胞数百分比记分：阳性细胞数小于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，大于75%为4分。按着色强度记分：染色呈淡黄色者记为1分，染色呈黄色者记为2分，染色呈棕黄色者记为3分。两种记分的乘积即为阳性强度：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.6 统计学处理方法 率的比较采用x2检验或Fisher精确概率法，相关性检验采用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 Survivin mRNA，Bcl-2在正常子宫颈、CIN、宫颈癌中的表达（见表1及图1～6） Survivin，Bcl-2阳性表达染色主要定位于细胞浆，呈淡黄色或棕黄色颗粒，局灶性或弥漫性分布。由表1可见，Survivin，Bcl-2在正常宫颈组织中不表达，在宫颈癌和CIN中表达的阳性率显著高于正常宫颈组织（P<0.01），且在宫颈癌中表达的阳性率高于 CIN（P<0.01）。

表1 Survivin，Bcl-2在正常子宫颈、CIN和宫颈癌中的表达

图2 Survivin mRNA在CIN中的弱阳性表达(ISH，×400)

图3 Survivin mRNA在宫颈癌中的阳性表达(ISH，×200)

图4 Bcl-2在正常宫颈组织中的阴性表达(SP，×200)

图5 Bcl-2在CIN中的弱阳性表达(SP，×200)

图6 Bcl-2在宫颈癌中的阳性表达(SP，×400)

2.2 Survivin，Bcl-2表达与宫颈癌临床病理特征的关系 Survivin，Bcl-2阳性表达与肿瘤组织分化、临床分期有关。Survivin的阳性表达还与淋巴结转移有关,随着肿瘤组织分化程度的降低和临床分期的升高，Survivin mRNA表达阳性率逐渐上升。宫颈癌IIb～III期组与I～IIa期组间、低分化组与中～高分化组之间，两者表达均有差异(分别为P<0.05或P<0.01)；Survivin在宫颈癌有盆腔淋巴结转移组中的阳性表达高于无淋巴结转移组(P<0.01)，而Bcl-2表达与宫颈癌的组织病理类型、肿块生长类型和淋巴结转移无相关性(P＞0.05)（见表2）。

表2175 例宫颈组织中Survivin和Bcl-2的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

Survivin基因是于1997年由Altier利用效应细胞蛋白酶受体1cDNA在人基因组库中首次筛选克隆出，定位于17q25。它是活性最强的凋亡抑制蛋白，主要通过间接或直接抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7的活性而发挥抗凋亡作用[2-3]。

Saiton等[4]采用RT-PCR技术研究了7种宫颈癌细胞株和25例宫颈癌组织中Survivin mRNA的表达，发现在所有的标本中均可检测到Survivin mRNA。在之后的定量测定中发现，Survivin mRNA的表达在宫颈癌细胞株中高于正常宫颈组织，而在88%的宫颈癌组织中其表达水平是正常组织的2倍。王梅等[5]又用免疫组化SP法从蛋白水平对宫颈癌中Survivin进行检测，发现59例宫颈癌组织中41例(占69.5%)有Survivin表达，而在10例正常宫颈组织中未发现Survivin表达。本研究亦发现Survivin mRNA在正常宫颈组织中未表达，在CIN和宫颈癌组织中逐渐升高，差异有显著性。随着组织分化恶性程度的增高，或肿瘤临床期别的增高，Survivin的阳性表达率亦相应上升，且其表达与淋巴结的转移亦有显著相关性。由此表明Survivin基因的表达与宫颈癌的发生、发展有密切相关，它可能预示着肿瘤具有较高的侵袭性和不良预后[6]。Survivin可能通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖而发挥其作用，因此Survivin基因是一个有潜在价值的肿瘤标志物[7]。

Bcl-2基因是最早在B细胞白血病和滤泡性淋巴瘤的研究中被发现的细胞凋亡抑制基因，定位于染色体18q21，它可通过封闭细胞核转运、抑制细胞内钙离子浓度升高、抗氧化而发挥抗凋亡作用。它是迄今为止研究较深入的抗凋亡基因之一[8]。在本研究中，发现Bcl-2蛋白同样在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌中有逐渐增高的表达，且两两之间差异有显著性，表明Bcl-2基因亦参与了正常宫颈组织-CIN-宫颈癌的病变过程。

同时，在本实验中还发现Survivin的表达和Bcl-2有正相关性，目前两者协同致病机制还不清楚。在CIN阶段Survivin和Bcl-2即有表达，提示此两基因在宫颈癌恶变的早期即有表达，且随着疾病的发展而进一步增强。宫颈癌IIb期以上患者的临床标本出现两者的高表达率，低分化标本出现高表达率等均提示两者表达与此类患者的不良预后有关，对临床治疗有指导意义。有报道称Survivin可在Bcl-2的下游阻断半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7凋亡调节通路[9]。

据推测两者可能通过相似的启动序列，共同协调转录而导致宫颈癌的病变。也可能是由于Survivin基因所在的染色体不稳定，导致t（14，18）易位，而引发Bcl-2基因转录激活，而细胞凋亡途径的紊乱则有利于肿瘤的生长和侵袭。两基因的异常表达可能协调促进细胞逃离正常的监控机制，抑制肿瘤细胞凋亡，促进异常增殖，参与宫颈癌的发生、发展。但由于研究时间短，缺乏研究对象生存时间的随访资料，因此联合检测Survivin和Bcl-2表达是否为宫颈癌预后的客观指标还有待深入研究。

实验结果表明，Survivin和Bcl-2在CIN和宫颈癌组织中的异常表达与宫颈癌的发生、发展有密切关系，两者呈正相关，其机制还有待进一步验证。

[1] Sasaki T, Lopes MB, Hankins GR, et al. Expression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, in tumors of the nervous system[J]. Acta Neuropathol,2002,104(1):105-109.

[2] Bartkova J,Lukas J,Muller H,et al. Cyclin D1 protein expression and function in human breast cancer [J]. Int J Cancer,1994,57(3):353-361.

[3] Shin S,Sung BJ,Cho YS,et al. An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and-7[J].Biochemistry,2001,40(4):1117-1123.

[4] Saitoh Y,Yaginuma Y,Ishikawa M. Analysis of Bcl-2,Bax and Survivin genes in uterine cancer[J]. Int J Oncol,1999,15(1):137-141.

[5] 王梅, 王冰, 王晓丽, 等. 凋亡相关基因Survivin在子宫颈癌组织中的表达及其与bcl-2、p53基因表达相关性的初步研究[J]. 中华妇产科杂志,2001,36(9):546-548.

[6] Kim HS,Shiraki K,Park SH. Expression of survivin in CIN and invasive squamous cell carcinoma of uterine cervix [J].Anticancer Res,2002,22 (2A):805-808.

[7] 顾桂芳, 张美云. 宫颈癌组织中survivin基因表达的临床意义[J].南京医科大学学报:自然科学版,2008,28(2):232-235.

[8] Sanz L,Garcia-Marco JA,Casanova B,et al. Bcl-2 family gene modulation during spontaneous apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells[J ]. Biochem Biophys Res Commun,2004,315(3):562-567.

[9] Deveraux QL,Takahashi R,Salvesen GS,et al. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases[J]. Nature,1997,388(6639):300-304.