线粒体-纳米材料生物毒性的主要作用靶点

陈芳 唐瑛 杨李

线粒体-纳米材料生物毒性的主要作用靶点

陈芳 唐瑛 杨李

1 纳米材料的性质

纳米材料(nanomaterial)是指三维空间尺度至少有一维处于纳米量级（1-100nm）的材料。尺寸大于原子簇，小于通常的微粒。纳米材料由于其独特的尺寸结构，具有如下效应：

①表面效应：纳米材料的表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随粒径的变化而急剧增大后引起的性质上的变化，即随着纳米粒子的粒径变小，纳米粒子的表面原子与总原子之比急剧增大，粒子的比表面积、表面能及表面张力也随着增加的效应，具有很高的化学活性。②小尺寸效应：由于颗粒尺寸变小所引起的宏观物理性质的变化称为小尺寸效应，当纳米粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的相与波长长度或透射深度等物理尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏，纳米粒子颗粒表面层附近原子密度减小，从而在声、光、电磁、热力学等方面产生一系列新奇的效应。③量子尺寸效应：块体材料的能带可以看作是准连续的，而介于原子和块体材料之间的纳米材料的能带将分裂为分立的能级，能级间的间距随颗粒尺寸减小而增大，当热能、电场能或者磁场能比平均的能级间距还小时，就会呈现出一系列与宏观物体截然不同的特性，这种现象称为量子尺寸效应。例如导电的金属在达到纳米级时可以变成绝缘体，磁距的大小与颗粒中电子数是奇数还是偶数有关，比热亦会反常变化[1-2]。④宏观量子隧道效应:微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应。宏观量子隧道效应限定了磁带、磁盘进行信息贮存的时间极限。

纳米生物材料从性质上可分为金属纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒和高分子纳米颗粒；从形态上可以将纳米生物材料分为脂质体、固体脂质纳米粒、纳米囊（纳米球）和聚合物胶束[3]。

2 纳米特性引发的特殊生物效应

纳米生物材料与传统的材料不同，具有很多特别的性质。纳米颗粒进入细胞并与细胞发生作用，主要是对跨膜过程和细胞分裂、增殖、凋亡等基本生命过程的影响和相关信号传导通路的控制，从而在细胞水平产生的生物学效应。

2.1 纳米材料的量子尺寸效应

与传统物质相比，纳米颗粒具有较高的表面活性，所以纳米颗粒容易透过血脑屏障、皮肤进入体内，进入血液循环系统,通过血液循环到达人体其他器官和部位。与普通颗粒相比纳米颗粒更易于从肺部转移至其他器官[4]。因为纳米材料尺寸通常在1～100 nm范围内，远小于细胞尺寸，所以比较容易透过细胞膜上的孔隙进入细胞内或细胞内的各种细胞器内，包括线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体和细胞核等，并和生物大分子发生结合或催化化学反应，使生物大分子和生物膜的正常立体结构发生改变。其结果将导致体内一些激素和重要酶系的活性丧失，或使遗传物质产生突变导致肿瘤发病率升高或促进老化过程[5]。

2.2 纳米材料的表面效应

颗粒表面的原子数多，周围缺少相邻原子，存在许多空键，故具有很强的吸附能力和很高的化学活性。纳米粒子的表面活性很高，能产生自由基(活性原子或者活性分子)，这些自由基可以导致细胞膜被破坏，使颗粒进入这些细胞之内，所以纳米颗粒引起的毒性更大，促使癌变细胞凋亡。常规药物被纳米颗粒物装载后，急性毒性、骨髓毒性、细胞毒性、心脏毒性和肾脏毒性明显增强[6]。

2.3 纳米材料表面改性或者涂层

由于纳米颗粒的表面疏水性及大的体表比，它在生物体内容易团聚，吸附血浆蛋白，易被网状内皮系统（RES）清除，因此，需要对纳米颗粒进行表面改性，增大亲水性，延长循环半衰期。表面涂层不仅能增加颗粒的稳定性，还可以与多种生物配体结合。纳米材料表面改性或者涂层表面连接上了一些特异基团成为生物反应位点。在使用纳米材料作为药物载体的时候，为了达到特殊目的，如：改善溶解性；提高其透膜能力；使其能透过血脑屏障或者靶向某一特异受体，都需要进行表面改性[7]。

3 纳米材料对线粒体结构和功能的影响

线粒体广泛存在于真核细胞的细胞质中，是一种由双层单位膜围成的细胞器。线粒体一般呈圆形、近圆形、棒状或线状，大小约0.3～0.8 m×0.4～3 m。线粒体是细胞呼吸的主要场所，三羧酸循环在线粒体基质中完成，通过呼吸链的氧化磷酸化在内膜上完成。在线粒体中葡萄糖、脂肪和氨基酸氧化分解释放的能量，以高能磷酸键形式贮存在三磷酸腺苷（ATP）中，细胞生命活动需要的能量大约有95%来自线粒体中形成的ATP，故线粒体被称为化学能转换器和细胞内能量供应的“动力工厂”。此外，线粒体还有贮存Ca2+的作用，线粒体DNA能够复制，并有相应的蛋白质合成系统，但线粒体蛋白质大部分是由核控制。线粒体的增殖和生长是核基因和线粒体基因相互作用的结果，线粒体以分裂方式进行增殖。

纳米颗粒进入细胞并与细胞发生作用，主要是对跨膜过程和细胞分裂、增殖、凋亡等基本生命过程的影响，以及对相关信号传导通路的调控。纳米材料的小尺寸效应以及比表面大的效应，使其比较容易透过细胞膜上的孔隙进入细胞内或细胞内的各种细胞器内，特别是线粒体内，并和生物大分子发生结合或催化化学反应以及活性氧的产生，使生物大分子和生物膜的正常立体结构发生改变[8-9]。其结果将导致体内一些激素和重要酶系的活性丧失，或使遗传物质产生突变导致肿瘤发病率升高或促进老化过程。

3.1 自由基理论

自由基是指外层轨道上有不成对电子的化学物质，这些自由电子导致了这些物质的高反应活性。自由基在细胞内的产生有多种原因，如生物氧化、辐射、受污染、细胞内酶促反应等均会释放自由基、氢自由基、羟自由基、脂质自由基、过氧化脂质自由基等，来自分子氧与多种不饱和脂类的直接作用，也可来自分子氧的相互作用。自由基性质活泼，易与其他物质反应生成新的自由基，而后者又可进一步与基质发生反应，从而引起基质的大量消耗及多种产物形成。细胞内具有清除过多自由基的机制，可以通过细胞内部的自身隔离化使产生自由基的物质或位点与细胞其他组分分开；细胞内有保护性的酶，主要是氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT)；还有其他抗氧化分子，如维生素C和维生素E，是自由基有效反应的终止剂。

生物膜上含有多种脂质，脂质中又含有各种不饱和脂肪酸，脂肪酸与自由基发生反应，进行过氧化作用，使膜流动性降低，膜蛋白变性，膜脆性增加，膜结构发生改变，导致膜的运输功能紊乱以致丧失。线粒体内膜是最靠近线粒体产生氧自由基的部位，因此最容易引起过氧化损伤。线粒体内外膜的通透性差别最大，外膜允许电解质、水、蔗糖及小于10 kD的分子自由通过，内膜与外膜正好相反，内膜在正常情况下不允许离子、蔗糖等透过，仅允许不带电荷的小分子通过，如水、氧、二氧化碳、尿素及甘油等，故非脂溶性的抗氧化物质不易进入线粒体。所以当氧自由基分子增多时，线粒体的膜系统可受到损害，从而影响跨越线粒体膜的质子梯度，使线粒体合成ATP的功能发生障碍。同时，线粒体的功能障碍又可导致自由基产生增多，过多的氧自由基不能被及时清除，又可引起生物蛋白和脂质过氧化，损害线粒体膜的通透性，引起电子传递链活性的进一步下降，进而形成恶性循环，使氧自由基生成进一步增加，最终造成细胞及组织的坏死。

3.2 纳米粒子毒性的活性氧机制

活性氧ROS包括过氧化氢(H2O2)，羟自由基(OH·)，超氧阴离子(O-2)，谷胱甘肽还原酶和过氧化氢酶均能清除活性氧。线粒体、膜脂质、蛋白、核基因均可成为活性氧攻击的目标。活性氧不仅攻击生物膜磷脂中的不饱和脂肪酸,形成脂质过氧化物；且能与DNA分子中的碱基或脱氧核糖作用，造成DNA分子链断裂；另外还可与蛋白质分子相互作用，造成蛋白质巯基破坏，蛋白质交联，使生物活性分子失活。由于内质网和线粒体较接近，能互相影响各自的功能，因此，线粒体中产生活性氧，使得内质网膜上的脂质超氧化，并破坏内质网的蛋白。而内质网产生的少量活性氧以及内质网腔内钙释放入胞浆中，可引起线粒体的膜电位降低，触发线粒体MPTP孔开放，引起瀑布样级联反应，产生大量活性氧。因此，活性氧机制成为研究纳米颗粒毒性的一个重要方面。

无论在体内还是体外，各种化学成分的纳米颗粒均可被光照、UV照射或金属氧化还原诱导产生活性氧。如C60富勒烯、单壁碳纳米管 (single-walled carbon nanotuves,SWNTs)、量子点、超细颗粒物等，暴露于光、紫外线、过渡金属的条件下，均可导致活性氧ROS生成[10-13]。

粒径和化学组分不同的各种纳米颗粒物对线粒体的代谢也会产生影响，因为线粒体是自由基活化组织，因此可能改变ROS的产生，负载或干扰机体抗氧化防御机制。研究发现不同尺寸和化学组成的纳米颗粒均首先作用于细胞内的氧化还原细胞器线粒体[14]。因此，纳米颗粒的线粒体靶向性将使线粒体内部的活性氧产量增加或干扰细胞的抗氧化防御机制。C60-富勒烯被认为是产生超氧化物的纳米颗粒典型[15]。但最近发现金刚石纳米粒子没有细胞毒性，不能产生活性氧，是一种很有应用前景的生物材料[16]。 尽管各种纳米颗粒产生活性氧的确切机制还不很清楚，但是可能的机制包括以下几点[17-18]：

①C60富勒烯和 SWNT受到光激活后引起内部系统之间产生自由电子；

②如纳米颗粒的代谢通过细胞色素-P450，纳米颗粒可能产生氧化还原反应的活性中间产物；

③体内的炎症反应引起巨噬细胞释放氧自由基。

总之，纳米颗粒的小尺寸效应和表面效应使其潜在毒副作用具有独特性，而且纳米颗粒的化学成分和其他参数也共同决定了这一特性。我们既要利用这一面来抑制癌细胞生长，同时又要注意它对正常细胞的毒性。

3.3 线粒体与细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）又称为程序性死亡（programmed celldeath,PCD），是细胞一种生理性、主动性的“自杀行为”。自20世纪90年代以来，越来越多的肿瘤、发育生物学、神经生物学、免疫生物学家和其他生物学工作者以极大的热情致力于细胞凋亡的研究，使之成为当今生命科学研究中最引人注目的领域之一。2002年的诺贝尔生理学与医学奖就授予了从事细胞凋亡研究的科学家。生物膜在细胞凋亡中起着关键作用，细胞凋亡的关键事件大多发生在生物膜上。细胞器膜，特别是线粒体膜在凋亡信号的接受、整合和放大中起着关键作用。

线粒体不仅是细胞的能量工厂，提供真核细胞代谢需要的能量，而且还是细胞凋亡的调控中心，线粒体可被形象地比喻为细胞凋亡信号的中继站。在细胞受到凋亡刺激后，线粒体接受到凋亡信号，并加以整合，然后通过释放凋亡相关物质，对凋亡信号进行放大。

尽管不同类型的细胞凋亡表现形式不同，基本的凋亡信号转导机制却大致相似。凋亡信号被细胞接受后，通过某种形式激活Bcl-2家族促凋亡分子，这些分子可转移到线粒体，促使线粒体释放细胞凋亡因子如细胞色素c、Smac、AIF等。这些分子可激活caspase依赖或者caspase非依赖的细胞凋亡机制，引起细胞凋亡。线粒体本身不仅能整合凋亡信号，还可作为细胞凋亡信号的直接接受器和作用靶点，在凋亡过程中释放大量自由基和内切核酸酶G(endonuclease G)及丝氨酸蛋白酶(Serine protease)等，作为细胞凋亡的直接执行者。很显然，细胞凋亡信号的整合和放大必须受到严密调控，也就是说，细胞凋亡物质从线粒体释放必须受到严密调控。

许多文献报道纳米粒子具有抑制癌症细胞作用，其中最典型的就是纳米HAP抑制癌细胞生长如：肝癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、骨肉瘤细胞等。而所有的研究只是从癌细胞形态上来判断纳米粒子具有促使癌细胞凋亡的功效，其作用的分子机制不是十分清楚。近期有文献首次报道了纳米HAP对胃癌SGC-7901细胞影响的分子-机制，结果表明纳米HAP抑制胃癌SGC-7901细胞的生长，促使其凋亡。其特征是DNA降解，细胞程序死亡最明显的形态变化是细胞变圆，细胞核分裂及细胞质浓缩[19]。在凋亡过程中伴有促凋亡蛋白Bax表达增加，抑凋亡蛋白Bcl-2减少，线粒体的膜电位下降，从线粒体释放的细胞色素C进入到细胞浆，而且使caspase-3和caspase-9激活但caspase—8没有被激活，所使用Caspase酶抑制剂Z-VAD-FMK剂量是依赖纳米HAP的量。表明纳米HAP诱导胃癌细胞凋亡路径可能是通过依赖线粒体和Caspase酶路径[20]。还有纳米三氧化二砷诱导U937细胞凋亡的分子机制探讨与之相似[21]。探讨不同纳米粒子抑制癌细胞增生的分子机制是目前生物界研究的重点之一。

4 展望

纳米科技的发展将给人类带来很多恩惠,推动人们加深对物质世界和生命科学的理解。但是在迅猛发展的纳米浪潮中,我们不能忽视任何事物都具有的两重性质。活性氧的产生以及细胞凋亡都聚焦于线粒体，因此纳米粒子毒性活性氧机制以及纳米颗粒诱导癌细胞凋亡路径都和线粒体存在很大的关系。纳米颗粒可以诱导自由基的产生，导致体内氧化应激，因此产生了生物毒性作用；纳米颗粒对细胞凋亡过程产生特殊的影响，可以用来抑制癌细胞增生，也是人们关心的重要问题之一。纳米粒子作用细胞线粒体产生的活性氧以及纳米粒子诱导癌细胞凋亡的机制探讨，对于我们怎么利用他们以及怎么来控制他们提供关键性的指导作用。目前人们对纳米粒子毒性活性氧机制以及诱导细胞凋亡的分子机制还不是很清楚，只是对之有一个初步的探讨，还没有进行深入的研究，实验数据有限。这一方面需要更长时间的积累数据、分析归纳，才能发现和揭示作用机制，才能建立相应的理论体系；另一方面，也迫切需要建立纳米粒子作用线粒体研究的新的实验方法学。因此，纳米科学技术是一个长久的、持续的研究开发的过程，为人类合理应用纳米材料提供科学依据.

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陈芳（1979.09-）女，硕士，技师。研究方向：纳米材料在细胞器内的活性研究。

2010-03-10）

广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430070