人体口腔微生物群的相互作用

施文元 周学东

（1.美国加州大学洛杉矶分校牙学院，美国 洛杉矶 CA 90045；2.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川 成都 610041）

口腔微生物群由超过700种细菌组成[1]。大量临床研究显示，口腔微生物群与人体两种常见口腔疾病：龋病、牙周病有着密切的关系。在很长一段时期里，口腔微生物学家使用简化论的研究手段，希望找出与口腔微生物疾病发病机制相关的关键病原微生物。但简化论的局限性促使科学家们采取新的策略并提出了种群间相互作用、微生物群落、生物膜以及多微生物疾病等新概念。这些新的研究使口腔微生物学家们真正认识到整体不是部分的简单叠加，不同成分的相互作用会产生新的生理反应，这些反应在单独研究这些成分时是无法观察到的。本文重点讨论人体口腔微生物群的相互作用。

1 口腔微生物群

Van Leeuwenhoek（1632—1723）最早开始对口腔微生物的最初观察[2]。他对3 d不清洁的牙齿进行研究，发现在前牙牙龈上方的少量物质中有一些活着的微小动物，并绘制这些微小生物的草图，标志着口腔微生物群落研究的开始。

Miller在Robert Koch博士的实验室寻找导致龋病的“细菌”。1890年，他在《人类口腔中的微生物》一书中，首次提出关于龋齿发生的“化学细菌学说”，认为牙菌斑生物膜由微生物组成。在频繁摄入可发酵糖类的易感宿主中，菌斑微生物将这些糖类转化为酸，导致牙齿脱矿。以Miller的化学细菌学为基础，进一步获得的临床证据提示了牙菌斑生物膜在人体口腔疾病发生中的病原性。根据发生部位与龈缘的关系，牙菌斑可分为龈上菌斑和龈下菌斑。龈上菌斑以革兰阳性链球菌为优势细菌，构成了牙齿平滑面的微生物群落。当饲以恰当的代谢底物时，这些群落就可能导致龋病的发生。龈下菌斑以革兰阴性厌氧菌为优势菌，它们在牙周袋内形成群落并可导致牙周病。Miller第一个提出去除菌斑是口腔疾病治疗的基础。

从1924年Clarke[3-4]对变异链球菌的初次分离到最近的以16S rRNA/DNA为基础的大量口腔研究，已发现了人体口腔中超过700种细菌（革兰阳性菌、革兰阴性菌和古细菌），使得口腔微生物群落成为人体最复杂的微生物集群之一。

龈上菌斑以革兰阳性菌为优势菌，包括血链球菌、变异链球菌、缓症链球菌、唾液链球菌和乳杆菌，而龈下菌斑则主要由革兰阴性厌氧菌构成，如放线杆菌、伴放线放线杆菌、福赛斯坦纳菌、弯曲杆菌、二氧化碳噬纤维菌、啮蚀艾肯菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌，以及口腔螺旋体如齿垢密螺旋体。在这两种情况下，牙齿和牙龈组织上的微生物群落可在局限环境中积聚高浓度的细菌代谢产物（如脂肪酸代谢终产物、氨、过氧化氢、氧化物和二氧化碳），既会影响宿主，也会影响口腔微生物群中的细菌种群。

2 以群为基础的口腔微生物发病机制

根据Koch的假说，对口腔微生物群分离和鉴定使微生物学家将特定微生物种属与特定疾病联系起来[5]。龈上菌斑中产酸的变异链球菌与龋病。医学上的病原体都是“外来者，具有特殊的毒力因子”。口腔变异链球菌则不同，它是口腔常驻菌群的一部分，虽然表达一定的病原因子（如产酸），与邻近的细菌通过协同或拮抗的生态相互作用达到动态平衡，并非造成损害。在复杂的口腔微生物群中，并不是由单一一种细菌的行为决定整个复杂群落的行为，而是由口腔微生物群的相互作用来决定。当与邻近的产碱细菌一起作用时，变异链球菌对宿主可能并不具有病原性[6-7]。因此，目前普遍认为，龋病并不是仅由变异链球菌或其他任何一种菌斑中的细菌单独引起的，而是由各种产酸菌，如变异链球菌与生物膜中其他成员相互作用的结果。这个以群落和微生物生态为基础的病原理论为理解牙菌斑与宿主健康或疾病的关系提供了新的视角，也为疾病预防及治疗提供了新的手段。

多种属群落可导致多重感染，多种细菌协同作用可致病。牙周病就是最好的例子。临床研究提示，牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌是成人牙周病生态中的致病联合体。通过对牙周病发病机制的进一步研究可以促进对这种多重感染中不同毒力因子作用的认识，为研究者提供发展针对多重感染的传统诊断、预防及治疗措施的重要信息。

口腔具有复杂的多种属微生物群落。在形成生物膜结构、执行生理功能和导致微生物致病的过程中，群落成员间应具有广泛的相互作用。这些相互作用包括营养竞争、生存的协同作用、拮抗作用、毒力因子的中和作用、生长依靠信号机制干扰等。

3 口腔微生物群相互作用的物质基础

营养供给是决定口腔微生物群组成的一个重要因素。要适应特殊的环境，如口腔，微生物发展出了可以有效利用这种生态微环境中的营养物质的代谢途径[8-10]。口腔微生物群的营养物质来源于食物的周期性摄入、唾液、其他微生物的代谢产物，以及菌斑中的多糖。当人类膳食中具有大量蔗糖时，变异链球菌相对于其他细菌可能会具有一种竞争优势。变异链球菌比其他细菌更高效地代谢蔗糖，将蔗糖快速转化为乳酸，具有很强的耐酸性。变异链球菌将蔗糖转化为黏性葡聚糖分子的能力也促进其对牙齿的黏附。缺乏这种能力的细菌则会被葡聚糖无差别捕获，并参与菌斑的发育。

牙龈卟啉单胞菌是牙周病的主要病原因素之一，常常与其他牙周病原菌如中间普雷沃菌、具核梭杆菌、福赛斯坦纳菌及齿垢密螺旋体共存。Grenier和Maryrand研究证实了牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的营养共生。在共同培养中，牙龈卟啉单胞菌可以通过代谢齿垢密螺旋体产生的琥珀酸盐来促进自身的生长。牙龈卟啉单胞菌分泌的异丁酸也可刺激齿垢密螺旋体的生长。Yoneda等[11]近期研究证实，具核梭杆菌和福赛斯坦纳菌的细胞提取物可以刺激牙龈卟啉单胞菌的生长，具体的生长刺激因子尚未鉴别。

口腔微生物的另一个重要营养来源就是唾液及龈沟液中的蛋白质，由宿主组织及细菌产生。当唾液蛋白质成为有限的营养来源之一时，能够水解蛋白质的微生物便具有竞争优势。对龈下菌斑中的细菌来说尤其如此，革兰阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌可以稳定定植于该区域并导致牙周炎的原因之一与其高度的蛋白水解作用有关。当其他蛋白水解能力相对较弱的细菌与牙龈卟啉单胞菌共生于生物膜中时，亦可受益于其他细菌的蛋白水解活动。因此，可以预计具有这种共生关系的微生物在生物膜中是应该紧密相邻的。

牙菌斑生物膜中两种生物间的协同或互惠作用对唾液的依赖已经由内氏放线菌和口腔链球菌证实。在唾液包被表面，任何一种细菌单独定植都很困难，可是两者一起却可以在同一表面上形成广泛的生物膜。这可能是由于两者对唾液成分联合代谢作用的结果。

4 影响口腔微生物群相互作用的主要代谢产物

一种生物的代谢产物很可能对同一生物膜中种群间产生影响。具有较高比例的变异链球菌菌斑往往血链球菌的水平会被抑制。前者可将蔗糖代谢为乳酸，这是细菌代谢酸中酸性最强的一种。相对于血链球菌，变异链球菌具有更强的耐酸性，乳酸更有利于变异链球菌的生存[12]。血链球菌则可以代谢产生过氧化氢，这是一种非特异性抗菌剂，对包括变异链球菌在内的其他共生菌具有拮抗作用，因为它们没有能有效代谢这种有毒物质的系统。许多厌氧菌，包括与人体牙周病相关的细菌也对氧化物敏感。因此，血链球菌水平相对较高的菌斑，变异链球菌水平及牙周炎相关菌如牙龈卟啉单胞菌水平则较低。而且牙菌斑中血链球菌的存在与牙周致病菌低水平相关，有助于口腔健康。

一种生物的代谢产物也可以促进种群间的生长。变异链球菌产生的乳酸可以被韦荣球菌稳定代谢。韦荣球菌存在于菌斑形成的早期。最近有研究发现，寡发酵链球菌亦可代谢变异链球菌产生的乳酸。寡发酵链球菌最初从无龋人体口腔中分离，其在菌斑中的数量增加与变异链球菌数量呈负相关。这种非致龋链球菌还能抑制变异链球菌的生长。这种抑制作用的机制非常独特。寡发酵链球菌通过乳酸酶的作用将变异链球菌产生的乳酸（这种在通常情况下是生长抑制剂的物质）转化为过氧化氢，过氧化氢则对变异链球菌具有高度毒性。

口腔微生物群之间存在合作代谢现象。一些种属的细菌可以改变局部微环境，使其有利于其他种属细菌的生长。具核梭杆菌和中间普雷沃菌可以在pH5.0～7.0的较宽范围内生存，牙龈卟啉单胞菌则不能在pH低于6.5的环境中生存。Takahashi[13]近期研究表明，使用谷氨酸和天门冬氨酸者两种唾液中的主要氨基酸作为饲养底物，具核梭杆菌和中间普雷沃菌可以产生有机酸和氨，使菌斑环境接近中性，使pH值即使在产乳酸细菌和可发酵糖类存在的情况下也不至于剧烈下降，可保护酸敏感细菌如牙龈卟啉单胞菌免予酸攻击。

微生物代谢中产生的氧气、二氧化碳等气体可以影响生物膜细菌相互作用。一些牙周病细菌在内的高度厌氧菌需要在高厌氧环境下方能增殖。因此，可以代谢氧气的细菌有利于周围厌氧菌的生存。除了使环境保持中性有利于牙龈卟啉单胞菌生存外，具核梭杆菌还可以形成其生存所必需的嗜二氧化碳微环境。虽然具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌都是厌氧菌，但其对氧气的耐受能力差别很大。牙龈卟啉单胞菌对氧气非常敏感，但具核梭杆菌可以耐受20%的氧气含量[14]。有趣的是，当在恒化培养基中与具核梭杆菌一起培养时，牙龈卟啉单胞菌甚至能在含20%氧气的气体环境中进行生长。这很可能是由于具核梭杆菌活跃的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide－reduced，NADH）氧化酶/过氧化物酶的作用，使其能够代谢氧分子和过氧化氢，为牙龈卟啉单胞菌形成了理想的厌氧环境。同时，具核酸杆菌还能为牙龈卟啉单胞菌提供生长所需的二氧化碳。

5 细菌素对口腔微生物群的作用

细菌可以产生对其他细菌具有特异性或非特异性作用的产物，如细菌素。细菌素是所有主要种系的细菌都可产生的蛋白质毒素。与抗生素不同，细菌素的杀菌谱较窄，只对相关细菌起作用。口腔链球菌产生细菌素的能力最强。许多口腔链球菌都可以产生肽类细菌素。变异链球菌至少可以产生5种细菌素[15]：变链素Ⅰ至Ⅴ。变链素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ属于含羊毛硫氨酸的乳链菌肽，抗菌谱相对较宽，变链素Ⅳ、Ⅴ则是未修饰的非乳链菌肽，变链素Ⅳ对缓症链球菌家族成员作用特别活跃。一项最近的变异链球菌UA159菌株基因组研究表明,其含有至少9个变链素编码推定基因，提示了变异链球菌可作用于其竞争者的全部手段或“武器储备”[16]。许多研究提示，变链素的作用与变异链球菌在口腔生物膜中的普遍存在及成功定植是相关的。一些细菌素也可抑制血链球菌的生长，这可能是变异链球菌水平较高的菌斑中血链球菌水平较低的原因之一。因此，一些生物膜成员的细菌素表达可能决定了其共生菌的种类。

细菌素也可通过作为信号分子相似物发挥作用来影响种群间的相互作用[17]。酿脓链球菌和唾液链球菌产生的羊毛硫细菌素在结构上彼此相似，并可与彼此的双组分信号系统相互作用。这两种细菌均可在黏膜表面定植，并通过拮抗生长依赖性信号传导抑制对方的生长。因此，共生的唾液链球菌和以阻止具有毒力的酿脓链球菌形成生物膜。

其他的抗微生物成分也可对一些细菌的信号转导系统产生作用。这类物质包括生长抑制因子。在亚致死浓度下，没有观察到它们对信号传导的作用。这种相互作用就可以影响有毒力的生物膜依赖基因的表达。

许多口腔微生物都能使用细菌素样成分与其他种属的细菌竞争[18]。Teanpaisan等[18]使用琼脂覆盖及扩散的方法证实，44种从牙周部位分离的产黑色素厌氧菌，包括牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌，变黑普雷沃菌能够产生细菌素样物质并对其敏感。分离并鉴定了变黑素的遗传决定因素——一种由变黑普雷沃菌产生的4.1×104经典细菌素，对牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌，福赛斯坦纳菌及放线菌属均具有杀菌作用[19]。

其他口腔细菌的细菌素及细菌素样作用已被广泛报告和证实[20]，包括中间普雷沃菌、二氧化碳噬纤维菌、伴放线放线杆菌、流感嗜血杆菌、具核梭杆菌，啮蚀艾肯菌。然而，它们的生化特性和遗传决定因素尚未充分研究。齿垢密螺旋体基因组测序显示其至少有3个潜在细菌素分泌系统，提示这个菌属的细菌也可能具有细菌素分泌功能。

分子学和遗传学最新研究[21]显示，细菌素的产生受到严格的调控，受细胞密度、营养供给、pH等环境因素以及遗传因素的共同影响。这些调节系统使得细菌素在恰当的时间和部位产生，以有效地在口腔微生物群落生态平衡中发挥作用。

人体口腔微生物群的稳定只有在同一生物环境中的不同种群间达到生态平衡才能获得，往往是生物群落中生态活动的结果[22]。口腔细菌产生并对细菌素和细菌素样物质敏感，使得细菌能够选择自己的“邻居”，促进了特定种属细菌群落的建立，并在口腔生态系中微生物群落之间的生态平衡中发挥重要的作用。

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