黑茶中微生物群落结构和多样性研究方法思考

刘石泉 雷存喜 赵运林*

( 1 湖南城市学院化学与环境工程系 湖南益阳 413000 2 湖南农业大学生物科学与技术学院 湖南长沙 410128 )

黑茶属于后发酵茶，是我国特有的一大茶类，其生产历史悠久、产区广阔、销售量大、花色品种多。黑茶加工过程中渥堆处理被认为是发展形成黑茶特有品质的关键工序，虽然不同花色品种所采用的渥堆技术条件不尽相同，但目的都是促使粗老的鲜叶原料通过一定程度的发酵，形成叶色黑润、味醇和、香气纯正、汤色黄红明亮的品质特征，实际上就是在微生物的作用下使以茶多酚为主的化学成分发生一系列的化学变化[1,2]。

尽管近些年微生物群落结构、多样性在其它领域成为研究的热点，但在黑茶发酵工艺中其研究远没有得到应有的重视。文献检索发现对黑茶的微生物研究主要集中在黑茶样品中微生物的种类组成、分离、鉴定、发酵条件、发酵产物等方面，而且主要是针对样品中的优势菌株进行研究。显然，黑茶中微生物群落结构和多样性的研究，对黑茶特有品质的高持续稳定特性的实现与强弱等有着非常重要的作用。因此，通过对黑茶发酵环境微生物群落的种群结构和多样性进行深入探查并研究其动态变化，可以为优化黑茶发酵群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。基于此，我们对目前黑茶发酵中微生物群落结构和多样性的研究现状、目前研究方法的局限性进行简要分析，以利于更好的研发这一特色产品。

1 黑茶中的微生物研究现状

黑茶发酵过程中微生物种类复杂，贯穿整个发酵流程，不同工艺时期、不同种类黑茶品质形成过程中的优势菌不一定相同，优势菌和非优势菌共同组成了渥堆中特有的微生物群落结构，各自发挥着应有的功能和作用。

1.1 黑茶加工中微生物种类

研究表明[3]，黑茶在加工过程中微生物群落主要是酵母菌、霉菌和细菌。温琼英[4]研究表明，黑毛茶渥堆过程中优势微生物种群是假丝酵母属中的种群、黑曲霉属、青曲霉属，初期还有大量细菌，主要是无芽孢小杆菌、芽孢细菌、金黄色葡萄球菌。

对普洱茶的研究[5,6]表明：主要微生物有黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉、酵母、蜡中枝孢霉和细菌。周红杰[5]发现，黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉和酵母等微生物存在于普洱茶整个渥堆发酵过程中，初期黑曲霉占到微生物总数的80%左右，后期灰绿曲霉开始繁殖。陈可可[6]等在不同产地的普洱茶中发现了温特曲霉烟色变种、帚状曲霉、具黄曲霉、埃及曲霉、臭曲霉、日本曲霉原变种、局限灰曲霉等多种曲霉。

六堡茶渥堆过程[7]中主要微生物有青霉、灰绿曲霉、黑曲霉、黄霉菌，其中曲霉、青霉。六堡茶在后发酵阶段也有少量金黄色散囊菌出现。

四川康砖茶[8]中还发现了放线菌属以及耐高温的葡萄球菌属和毛霉属。

茯砖茶制造过程中有一个独特的“发花”工序，产生大量金黄色的闭囊壳，研究表明[9]，其渥堆中主要微生物有冠突散囊菌、间型散囊菌、匍匐散囊菌、谢瓦散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、赤散囊菌、散囊菌、黑曲霉、毛霉、拟青霉、草酸青霉、短密青霉、谢瓦氏曲霉、冠突曲霉等。

1.2 黑茶中主要优势菌的作用研究

众多的研究表明[5,6,10]：黑曲霉能产生 20种左右的水解酶，其中可利用的糖苷酶、果酸酶、葡萄糖淀粉酶、纤维素酶、柚苷酶、乳酸酶、葡萄糖氧化酶等许多酶类，还可以分解包括多糖、脂肪、蛋白质、果胶、天然纤维和不可溶性化合物等有机物；并且它的异变菌可产生草酸、柠檬酸、葡萄糖酸、抗坏血酸等。青霉在渥堆过程中产生多种酶及有机酸，可产生葡萄糖氧化酶或葡萄糖酸、柠檬酸、柠檬酸霉素、抗坏血酸等；产黄青霉代谢产生的青霉素对杂菌、腐败菌可能有良好的消除和抑制生长作用。酵母菌类主要是产生酒精和产酯等生香酵母，有机物经酵母菌发酵后蛋白质、维生素A等物质的生物活性都会大幅度提高；酵母菌含有丰富的酶系统，如蔗糖酶、麦牙糖酶等以及生理活性物质，如辅酶I、辅酶A等；还能利用多种糖类代谢产生维生素B1、B2、C等。根霉属类具有多种酶系，它除了能分泌淀粉酶外，还能分泌酸性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等；其淀粉酶的活力很高，能产生有机酸，如反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸等，还能产生芳香的酯类物质，赋予产品独特的风味。冠突散囊菌[11]产生各种胞外酶（如多酚氧化酶、果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等），作为有效的生化动力，催化茶叶中各种相关物质发生氧化、聚合、降解、转化。从这些研究结果中，我们可以看出黑茶发酵过程中微生物的参与起了决定性的作用，参与黑茶发酵的微生物群落结构和多样性是十分复杂多样的，对黑茶发酵的微生物群落结构和多样性的分析研究显然是一个必须的选择。

2 黑茶微生物类群多样性研究现状

目前，微生物群落结构多样性的方法主要有培养基培养分离方法、群落水平生理学指纹方法[12]、生物标记物方法[13]、现代分子生物学方法主要包括有群落水平总DNA分析方法[14]，核酸杂交技术[15]，克隆文库方法[16]和基因指纹技术[17]等，方法众多，不能一一列举，但真正应用到黑茶微生物多样性相关研究还很少，文献检索表明，绝大多数的黑茶微生物研究主要集中在黑茶样品中微生物的分离、鉴定、微生物群落的简单种类组成等方面，主要的分离方法是将定量样品接种于特定的培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。显然，培养基培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用影响，这种人工环境与原生境偏差使得可培养种类大大减少（仅占环境微生物总数的 0.1%～10%[18]）。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测黑茶发酵过程中微生物种群结构的动态变化。对黑茶中微生物的多样性和相互作用研究远还只是起步。众多的群落水平生理学指纹、生物标记物、DNA分析方法等在黑茶微生物群落结构多样性的研究中，尽管可同时分析多个样品，快速直观，适合于研究微生物，分析微生物群落的结构组成与动态变化，但还远未发挥应有的作用。

3 黑茶发酵微生物群落结构和多样性研究的思考

3.1 研究对象的零碎性

黑茶的生产过程中微生物的生命活动和代谢产物是黑茶品质形成的重要因子。目前关于黑茶的微生物研究，大多是随机采样，就地取材[1,3]，对微生物的物种鉴定缺乏严谨，难免产生菌种鉴定的错误，而且在黑茶渥堆中特有的微生物群落的研究，主要集中在用传统的微生物培养、分离、鉴定方法研究其菌落组成，对黑茶的整个发酵流程的不同工艺时期、不同种类、不同产地黑茶品质形成过程中的优势菌和非优势菌共同组成的渥堆中特有的微生物群落结构的研究是零碎的、不系统的。由于黑茶微生物的群落结构及其多样性与黑茶的品质密切相关，只有系统地对各地黑茶生产中的微生物进行研究，才能全面揭示微生物对黑茶品质的影响。因此，需进一步加强对黑茶微生物群落结构和多样性的基础研究，揭示微生物在黑茶后发酵过程中的作用及机理，为黑茶的规范化生产和黑茶群体品牌的构建提供科学基础。为此，在全面采集和系统研究的基础上，建立黑茶后发酵微生物库，对于黑茶产业的可持续发展具有重要的意义。

3.2 研究对象的片面性

在微生物对黑茶品质形成的研究方面，对黑曲霉、酵母菌、灰色链霉菌、粉红色链霉菌、臭曲霉等几类优势菌株虽有一些报道[5,6,8,9]，但只是针对其代谢条件、产物、作用等方面孤立的报道，均不够深入和系统。基于微生物的群落结构和多样性特征，除进一步加强从分子水平上研究优势菌的作用机理外，还应对在数量上占中等、甚至微量的微生物群落进行整体研究，特别是注意研究微生物群落结构对黑茶品质转化的作用及其机制，对于揭示黑茶风味的物种基础，进行黑茶的规范化工业生产均具有重要的意义。然而，这方面的研究还很少，这就使得对整个黑茶的生产控制缺乏必要的科学根据，成为黑茶产业规范化生产主要的限制因素之一。

3.3 研究手段的单一性

目前黑茶中微生物的种类研究、微生物的功能作用研究等研究成果的取得，几乎都是靠传统的微生物分离培养鉴定等较为简单和初级的研究方法[4]，显然难以适应黑茶研究发展的需要。群落水平生理学指纹方法、生物标记物方法、现代分子生物学方法等目前较为成熟的研究技术还为真正应用到黑茶微生物发酵研究中来。这些方法在环境微生物群落结构和多样性研究方面有较为成功的经验，在黑茶发酵的微生物群落结构和多样性研究中借鉴和引入新的成熟的研究方法是推动黑茶飞跃发展的必由之路。笔者认为，目前黑茶发酵的微生物群落结构和多样性研究的单一性主要表现在两个方面，一是只是对可培养分离的微生物进行研究，对于目前还不可培养的微生物的研究目前还是一个空白。二是研究手段单一，未能进行各种方法的有效组合进行研究。

4 结束语

当然，每一类微生物群落结构和多样性方法都有自身的功能和局限性，也都在发展和完善当中，并相互补充相互推动。传统培养分离方法积累了种群分类的大量数据，为生物标记物方法和现代分子生物学技术提供了良好的背景材料（例如用作标准品或分子工具），在功能特性的认识上有独特的优势。生物标记物方法可快速进行单个微生物样品的群落结构和多样性分析，但在定性上依赖于传统培养分离方法。现代分子生物学提高了分析的灵敏度，在基因水平上扩大了物种多样性的视野，其中基因指纹技术可同时分析多个样品，直观显示了种群结构变化情况，有助于分析调控因子对群落结构和群落功能的影响。总而言之，加强黑茶后发酵过程中微生物群落结构和多样性的系统研究，阐明微生物在黑茶生产中的作用及其机理，开发黑茶，是实现黑茶的规范化生产，构建群体品牌，形成黑茶特色产业，并促进可持续发展的关键所在。

为了能够达到指导和调控黑茶发酵过程中微生物功能的发挥，获得黑茶应有的品质，黑茶微生物群落结构和多样性分析研究技术的发展趋势必然是原位、快速、灵敏、高通量和准确定量。

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