细胞移植治疗脑出血的研究进展

常能彬,余崇林

(泸州医学院 人体解剖学教研室,四川泸州 646000)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指原发性非外伤性脑实质内出血,绝大多数由高血压病伴发的脑小动脉病变在血压骤升时破裂所致,起病急骤、病情凶险、病死率很高。脑出血后,出血灶中心区神经细胞死亡导致神经功能缺损,至今尚缺乏真正有效的治疗措施和药物。目前,有多种措施可用于拯救病灶周围濒死的神经细胞,细胞移植治疗被认为是修复病死灶,恢复受损神经功能最有潜在应用价值的手段之一。

脑出血后神经修复涉及血肿吸收、缺血缺氧的改善、代谢的改善、血管再生、神经细胞的再生、纤维联系和突触的重建诸多方面。由于局部缺乏合适的微环境,脑出血后不能进行有效的神经再生,目前较好的治疗方法是通过移植替代缺失的神经细胞[1],重建受损的神经通路,改善局部微环境来促进神经功能的恢复。近年来,细胞替代治疗中枢神经系统损伤成为该领域的研究热点,是极具前景的治疗策略之一。

1 治疗脑出血移植细胞来源

1.1 神经干细胞移(Neural Stem Cells,NSC)

NSC具有自我更新、增殖能力和多向分化潜能,在特定条件下能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。对神经干细胞的研究,打破了传统的神经系统不可再生的理论,并获得了大量有价值的研究成果。Lee HJ等[2]通过注射胶原酶复制脑出血模型,术后立体定向移植神经干细胞于缺血灶,研究发现,注入的神经干细胞迁移至血肿周围区,在大鼠脑组织中存活、迁移并分化为神经元和星形胶质细胞,改善脑出血大鼠的神经功能缺损并有效延长神经功能恢复期。神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化,移植组大鼠运动功能较对照组明显改善。神经干细胞作为治疗脑出血在内的人类神经系统疾病的移植细胞来源有广阔的临床应用前景。

1.2 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)

MSC来源于发育早期的中胚层和外胚层,具有多向分化潜能、自我复制及很好的迁移性等特点而日益受到关注。体外培养可分化为神经元、胶质细胞,移植治疗脑出血可促进神经再生[3]。Liao等[4]将脐血来源骨髓间质干细胞在大鼠脑缺血模型建立24小时后移植到缺血灶,7d后脑缺血大鼠神经功能缺失症状明显改善,损伤程度、白细胞浸润减少,小胶质细胞激活,基质金属蛋白酶(MMPS)在移植3天后细胞治疗组较PBS对照组缺血区周围明显降低,认为脐血来源骨髓基质干细胞可能通过抑制炎性细胞,促进内源性再生。Liu等[5]利用表达肝细胞生长因子的MSC移植治疗脑出血大鼠,通过神经纤维髓鞘再生和轴突再生促进神经功能修复。Sey fried DM等[6]经静脉将大鼠骨髓基质干细胞(BMSCS)注入脑组织,细胞移行到缺血灶区域促进内源性神经再生,表达未成熟神经元标志的细胞数量明显增加。研究显示,在脑出血大鼠脑内MSCs可分化为神经元,且能明显改善运动功能[7]。

1.3 嗅鞘细胞(O lfactory Ensheathing Cells,OECs)

OECs是功能上介于许旺细胞和少突胶质细胞之间的一种特殊胶质细胞,具有神经营养、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等功能,可为轴突生长提供适宜的微环境并具有较强的迁移特性,使其成为促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。嗅鞘细胞位于中枢和周围神经系统,有独特的再生属性[8],近来被认为是通过细胞诱导修复神经系统疾病,包括脊髓损伤,中风等退行性疾病的潜在候选资源[9]。吴卫江等[10]用人嗅球来源和嗅粘膜来源嗅鞘细胞移植治疗脑出血大鼠,实验证明无论中枢还是外周来源的嗅鞘细胞均能达到改善受损神经功能的作用,移植人嗅鞘细胞可促进脑出血后轴突再生及髓鞘化,神经纤维再生,改善大鼠偏瘫功能。实验发现,在嗅鞘细胞移植治疗脑出血血肿周边及血肿灶中,OECs组的髓鞘化数量远多于对照组,神经纤维数量也多于对照组,说明OECs有修复神经元轴突髓鞘并促进轴突延长的功能[11]。

1.4 施万细胞(Schwann Cells,SCs)

SCs为周围神经胶质细胞,包绕周围神经轴突而形成髓鞘,可分泌多种神经营养因子、细胞外基质及细胞黏附因子,在促进中枢神经系统损伤修复中的作用越来越受到人们的重视。Wan H[12]等通过股动脉血提取施旺细胞并用BrdU标记,注射到基底神经节,通过免疫组化双染检测BrdU/髓鞘碱性蛋白(MBP)和BrdU/生长相关蛋白-43(GAP-43)的表达和电镜观察髓鞘再生,施旺细胞在大鼠脑出血时参与髓鞘再生,促进神经功能修复。

1.5 脂肪间质干细胞(Lipoaspirate Mesenchymal Stem Cells,PLA-MSC)

PLA-MSC是从脂肪组织抽吸物中获得的一种成纤维细胞形态的细胞群,其自我更新能力与多向分化潜能类似成体干细胞(adultste cells,ASC),最早由ZUK等[13]从抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离培养。脂肪源性的间质干细胞起源于中胚层,为多能干细胞,在恰当的诱导条件下能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及上皮细胞等定向分化,可跨胚层分化为神经细胞[14]。Fatar M等[15]通过静脉注射PLA-MSC,在脑出血24小时后,旋转测验发现移植组较对照组功能有明显改变,组织化学和MRI形态学观察组间损伤区域无变化,治疗组中内源性祖细胞双倍增加,通过移植脂肪间质干细胞的整合、分化和对内源性祖细胞的激活显著改善脑出血受损功能恢复。

2 脑出血治疗细胞移植途径

2.1 立体定位移植

在脑立体定位仪下将移植细胞直接注入脑内,虽然对脑组织会造成一定的损伤,但一次性注入的细胞量可以很大。在临床应用中,脑出血后在外科手术清除血肿的同时可结合患者的影像学资料确定适合的靶点,如：纹状体,侧脑室和受损脑组织周围,将细胞定位植入脑内特定部位,从而达到个体化治疗的目的。

2.2 经静脉注射

Sey fried DM等[16]静脉注射移植细胞可显著改善脑出血大鼠对神经功能的修复。经静脉途径移植操作简单、方便,对受体动物的损伤较小,但进入脑内的细胞数量较少。

2.3 经颈内动脉途径

颈内动脉向除部分颞叶和枕叶之外的大脑前3/4供血,经颈内动脉注射能减少手术对颅部造成的损伤。Guzm an R等[17]实验证明经颈内动脉注射可明显改善目的细胞传送到受损脑部位的效能,Li F等[18]在脑出血损伤后7～14天通过颈内动脉注射可更为有效的使神经干细胞到达损伤大脑半球。

3 辅助细胞移植治疗

Seyfried DM等[16]为增强M SC输送到脑出血损伤大脑,静脉注射甘露醇1.5 g/kg,经颈内动脉输注的MSC随着静脉输注甘露醇出现增幅,预先服用甘露醇的MSC输送效率于脑出血区域明显增加。Zhong PC等[19]将泻火补肾汤中药合剂经口喂养用5-脱氧尿苷酸(5-BrdU)标记的神经干细胞移植治疗的脑出血大鼠,发现泻火补肾汤通过诱导IL-4 mRNA的表达和抑制IFN-gammamRNA可促进移植神经干细胞的分化存活而改善受损神经功能。刘安民等[20]研究转人肝细胞生长因子(hHGF)人脐带间质干细胞(hUCM SCs)移植对脑出血后脱髓鞘再生和神经功能恢复的影响,肝细胞生长因子(hepatocyte grow th factor,HGF)可使梗死灶的面积减少、凋亡细胞减少、血管生成增加。近来研究发现,HGF对神经元的发育、存活和轴突生长与导向、轴突侧促生长及神经纤维的修复等均起重要作用,转hHGF人脐带间质干细胞移植较单纯细胞移植能明显提高神经纤维髓鞘再生能力,促进脑出血后神经功能缺失的修复。

4 细胞移植治疗脑出血的机制

4.1 移植细胞在一定条件下可以进行增殖、迁徙和分化,这些新生成的原位神经元可代替丢失的神经细胞[21],同时促进内源性再生[4]而发挥一定的功能。

4.2 移植细胞本身及其分化后分泌的多种神经营养因子,可激活内源性祖细胞再生。Lee H J等[2]报道,脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)可改善脑出血结构性和功能性的修复,用过度表达F3.BDNF因子、F3.GDNF[22]因子、Akt1的神经干细胞治疗脑缺血动物,可促进移植神经干细胞的分化、存活,宿主大脑内源性神经元再生的激活、血管再生和完成受损神经元功能的修复;过度表达VEGF的神经干细胞在鼠脑中风模型中能提供神经保护,促进内源性神经元再生和功能的修复[23]。4.3 移植细胞对抗脑出血引起的炎症反应。出血继发脑水肿,脑细胞凋亡释放炎症介质(如TNF-α,IL-6,NF-κappaB)等引起病理生理改变和临床症状。Kim JM等[24]在脑出血24后经静脉注射从人新鲜脂肪分离的脂肪间质干细胞,结果提示移植的脂肪间质干细胞可降低脑缺血动物脑部急性炎症反应,抑制脑萎缩与神经胶质增生,促进长远的功能性恢复并减少激活巨噬细胞分泌促炎细胞因子TNF,介导免疫调节修复出血大脑。

5 存在的问题和展望

细胞移植治疗脑出血已获得大量有价值的研究成果,但仍存在着诸多问题,期待更深入的研究进展。①对于特定的个体情况,选用何种细胞移植治疗是最恰当的,能否建立标准量表以客观评估选择用移植细胞来源。②移植细胞后,控制定向诱导分化的理论认识尚不成熟,还需对细胞在体内的分化诱导作更多的研究。③当前的研究证实移植细胞能促进机体内源性神经元增生,但其具体作用机制还了解不多,加强对脑内微环境、细胞因子及细胞信号传导通路方向的研究能否在这方面有所突破。④临床问题,如治疗病种的筛选、移植时间窗的确定、移植量、最佳移植途径选择、疗效及神经功能的评定标准、经济问题等。⑤联合细胞移植治疗已经在动物实验开展,并取得一定效果,但不同来源移植细胞对脑出血治疗的协同效应和作用机制还有待进一步深入研究。⑥中医活血化淤和电针刺激等辅助治疗对脑组织血供,血管神经物质调节,舒缩功能紊乱的改善能否促进脑出血的治疗,通过何种作用机制保护损伤脑组织恢复神经功能缺损。⑦在进行细胞移植前后损伤部位的影像学检查如3TMRI对治疗期间的跟踪随访,防止并发症的发生促进细胞移植对脑出血的治疗。

[1] Andres RH,Guzman R,Ducray AD,et al.Cell replacement therapy for intracerebral hem orrhage[J].Neurosu rg Focus,2008,24(3-4)：E16.

[2] Lee HJ,Lim IJ,Lee MC,et al.H uman neural stem cells genetically modified to overexp ress brain-derived neurotrophic factor p rom ote fun ctional recovery and neuropr-otection in a mouse stroke model[J].Neu rosci Res,2010,88(15)：3282-3294.

[3] Nagai A,K im W K,Lee H J,et al.Multilineage potential of stable human m esenchymal stem cell line derived from fetal m ar row[J].PLoSOne,2007,2(12)：e1272.

[4] Liao W,Zhong J,Yu J,et al.Therapeutic benefit of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells in intracereb ral hemorrhage rat：implications of an ti-inflammation and angiogenesis[J].Cell Phy siol Biochem,2009,24(3-4)：307-316.

[5] Liu AM,Lu G,Tsang KS,Li G,Umbilicalcord-derivedmesenchymal stem cells with forced expression of hepatocyte growth factor enhance remyelination and functional recovery in a rat intracerebral hemorrhagemodel[J].Neurosurgery,2010,67(2)：357-366.

[6] Seyfried DM,Han Y,Yang D,et al.Localization of bone mar row stromalcells to the injury site after in tracerebral hemorrhage in rats[J].Neurosurg,2010,112(2)：329-335.

[7] Zhang H,H uang Z,Xu Y,et al.Differen tiation and neurological benefit of the mesen chymal stem cells transplan ted in to the rat brain following in tracerebral hem orrhage[J].Neurol Res.2006,28(1)：104-112.

[8] Radtke C,W ew etzer K,Reimers K,et al.T ransplantation of olfactory ensheathing cellsasadjunct cell-therapy for peripheral nerve injury[J].Cell Transplant.2010 Aug 18,Epub ahead of print.

[9] Su z,H e c.O lfactory ensheathing cells：Biology in neuraldevelopment and regeneration[J].Prog Neu robiol,2010 Sep 15,Epub ahead of p rint.

[10] 吴卫江,陆华,葛风,等.不同来源嗅鞘细胞移植治疗脑出血的比较[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(6)：1118-1122.

[11] Tang ZP,X ie XW,Shi YH,et al.Combined transplantation of neural stem cells and olfactory ensheathing cells imp roves the motor function of rats with intracerebral hem orrhage.Biomed Environ Sci,2010,23(1)：62-67.

[12] W an H,Zhang SD,Li JH,Action of Schw ann cells im planted incerebral hemorrhage lesion[J].Biomed Environ Sci,2007,20(1)：47-51.

[13] Zuk PA,Zhu M,M izuno H,etal.Mu ltilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng 2001,7(2)：211-228.

[14] V ieira NM,Brandalise V,Zucconi E,et al.Isolation,characterization,and differentiation potential of canine adiposederived stem cells[J].Cell Transplant,2010,19(3)：279-289.

[15] Fatar M,Stroick M,Griebe M,et al.Lipoaspirate-derived adult m esenchymal stem cells improve functional outcome during in tracereb ral hemorrhage by proliferation of endogenous progenitor cells stem cells in intracerebral hemorrhages[J].Neurosci Lett,2008,43(3)：174-178.

[16] Seyfried DM,Han Y,Yang D,et al.Mannitol enhances delivery of marrowstrom al cells to the b rain after experimental intracerebral hemorrhage[J].Brain Res.2008,11(1224)：12-19.

[17] Guzman R,De Los Angeles A,Cheshier S,et al.In tracarotid injection of fluo rescence activated cell-so rted CD49d-positive neu ral stem cells improves targeted celldelivery and behavior after stroke in amouse strokem odel[J].Stroke,39(4)：1300-1306.

[18] Li F,Liu Y,Zhu S,et al.Therapeutic time w indow and effect of intracarotid neu ral stem cells transplan tation fo r intracereb ral hemorrhage[J].Neuroreport,2007,18(10)：1019-1023.

[19] Zhong PC,Li XQ,Liang QH,et al.Effects of X iehuo Bushen Decoction on su rvival and differentiation of transplanted neu ral stem cells in brains of rats w ith intracereb ral hem orrhage[J].Zhong X iY i Jie H e Xue Bao.2008,6(6)：626-631.

[20] 刘安民,罗铭,蔡望青,等.转肝细胞生长因子的脐带间质干细胞移植促进大鼠脑出血后髓鞘再生[J].中国病理生理杂志,2009,25(10)：1936-1940.

[21] Andres RH,Guzman R,Ducray AD,et al.Cell replacement therapy for intracerebral hemorrhage[J].Neurosu rg Focus.2008,24(3-4)：E16.

[22] Lee HJ,Park IH,Kim HJ,et al.Hum an neu ral stem cells overexpressing glial cell line-derived neurotrophic factor in experimental cerebral hemorrhage[J].Gene Ther,2009,16(9)：1066-1076.

[23] Lee HJ,K im KS,Park IH,et al.Hum an neu ral stem cells over-exp ressing VEGF provide neuroprotection,angiogenesis and functional recovery in m ouse stroke model[J].PLoS One.2007,2(1)：e156.

[24] K im JM,Lee ST,Chu K,et al.System ic transplantation of human adipose stem cells attenuated cerebral inflammation and degeneration in a hemorrhagic stroke m odel[J].Brain Res.2007,5(1183)：43-50.