铜绿假单胞菌获得性金属β-内酰胺酶及其相关基因研究*

蓝 锴，陈 茶，庞雪云，张 文，林海标

(广东省中医院检验科，广州 510120)

金属 β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)属 β-内酰胺酶Bush分类3群，Ambler分类B类，通常简称金属酶。该类酶的最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小;其活性不被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制。金属酶可由染色体和质粒介导，已在铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，Pae)、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌属等细菌中检出此类酶[1-2]。由于产生MBLs造成Pae对碳青霉烯类等多种抗生素耐药已成为Pae多重耐药的重要原因。为了解本院分离的Pae菌株金属酶产生状况，采用多种方法进行了金属酶检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2009年 8～9月本院住院患者的痰、胸腔积液、中段尿、脓液等标本，从其中分离的 Pae共计 86株，均用法国生物梅里埃Vitek-2全自动细菌鉴定/药敏分析仪鉴定到种。鉴定卡质控采用的标准菌株为阴沟肠杆菌ATCC700323(广州华鑫科技有限公司惠赠)。

1.2 药物敏感试验 采用K-B法进行药敏试验。MH平板购自广州迪景生物有限公司;药敏纸片购自Oxoid公司;药敏试验结果判断采用美国CLSI2009年标准[3]。检测15种抗菌药:哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、氨曲南、头孢他啶(CAZ)、头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、复方新诺明、亚胺培南(IMP)、美罗培南、妥布霉素。药敏质控所用标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922，PaeA TCC27853，购自卫生部临床检验中心。

1.3 MBLs检测 用CAZ及IM P纸片进行金属酶初筛，如果CAZ≤14 mm，或IM P≤13 mm，提示该菌株可能产生金属酶[4]。按参考文献[5]采用双纸片协同法进行金属酶确证实验，以 EDTA和2-巯基丙酸(2-MPA)作抑制剂，分别与 CAZ、IPM纸片组合进行双纸片协同试验。

1.4 耐药基因检测 采用煮沸法提取细菌DNA后，用PCR对4种编码金属酶基因 IMP-1、GIM、SPM、VIM 进行扩增[6]，其引物序列和目的产物长度见表1。PC R扩增体系为:P 1、P2引物各0.5μmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO48 mmol/L，MgCl22 mmol/L，Tris-HCl(pH 9.0)10 mmol/L ，0.5%NP40，0.02%BSA(质量浓度)，Taq DNAase 1 u，共15μL，另加入模版DNA5μL。循环参数为:92℃预变性5 min;93℃、60 s，55℃、60 s，72 ℃、60 s，循环35次;最后 72 ℃延伸5 min。 PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察分析，记录结果。

2 结 果

2.1 药敏试验结果 86株Pae对所选择15种抗菌药的敏感率、中介率及耐药率结果见表2。

2.2 金属酶检测结果 CAZ耐药率为44.2%，IMP耐药率为27.9%，同时耐这两种药的菌株有 18株(21.2%)。对CAZ或IMP耐药的总菌株数为46株，金属酶产生率为53.5%。将这46株阳性菌株进行金属酶确证试验，其中CAZ/EDTA阳性12株(13.95%);CAZ/2-MPA阳性13株(15.12%);IMP/EDTA阳性15株(17.44%);IMP/2-M PA阳性16株(18.60%)，见表3。

表1 耐药基因引物序列及目的产物长度

表2 86株Pae药敏试验检测结果

2.3 耐药基因检测结果 将阳性菌株进行4种金属酶基因检测结果显示:IPM-1阳性14株(16.28%)，而GIM、SPM、VIM均无阳性检出。双纸片协同试验及IMP-1阳性结果见表3。

表3 PC R与纸片法阳性结果比较

表3 (续) PCR与纸片法阳性结果比较

3 讨 论

用纸片法进行MBLs检测的原理是利用金属鳌合剂可以与酶活性位点上的Zn2+结合从而抑制金属酶活性。常用抑制剂有EDTA、2-MPA、2-巯基乙醇、巯基乙酸(SMA)。金属酶的检测目前国际上尚无统一标准，从本组检测结果来看，CAZ、IMP及其相应抑制剂检测结果也并不一致。其中，用IM P/2-MPA检测的阳性率最高。有学者在大样本的Pae和鲍曼不动杆菌金属酶表型筛选方法的研究中发现，EDTA对Pae的敏感性好，而2-MPA对鲍曼不动杆菌的敏感性好[5]。已有资料显示，使用2-MPA能有效地将IMP-1酶与丝氨酸AmpC酶等分开，其特异性和敏感性接近于用IMP-1做引物检测的结果[7]，且简单易行，可操作性强。但是2-MPA具有一定的毒性，在临床应用上会受到一定限制。此外，还可以用E-test法和微量稀释法检测金属酶[8]。

Pae作为一种条件致病菌随着抗生素滥用而呈现日益增多的趋势，2002年全国细菌耐药性监测网所属57家三级甲等医院调查发现，Pae临床分离率仅次于大肠埃希菌列第2位，且该菌对多种临床常用药物的耐药率为15.2%～78.4%[9]。金属酶是一个异基因家族，不同的酶相互之间的一级结构表现出低水平的序列相似性，但三维结构呈现高水平的相似性，综合起来有以下主要特征:(1)能水解碳青霉烯类抗生素;(2)对单环类药物敏感;(3)对鳌合剂敏感;(4)对锌离子有依赖性。到目前为止，共发现 IMP、VIM、SPM 、GIM 和SIM 5个不同家族的金属酶[5，10]。产M BLs造成 Pae对碳青霉烯类等多种抗生素耐药已成为Pae多重耐药的重要原因。据文献报道，IM P和VIM是两类最主要的 MBLs，而在本组检测中，仅IM P-1出现阳性结果，VIM、SPM、GIM检测均呈阴性，说明不同地区Pae金属酶基因携带情况不尽相同。到2004年底，IMP家族共发现了10余种不同亚型的金属酶，包括 IMP 1～16。IMP-1是最早发现的Pae所产金属酶，水解底物较广，包括青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类，但不能水解单环β-内酰胺类[11-13]。本组检测结果显示，具有IMP-1型金属酶可能是本院住院患者对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。

多重耐药菌株的不断出现使碳青霉烯类抗生素使用量激增，将为金属酶提供选择压力，可能会使更多沉默的金属酶基因激活表达，进一步恶化耐药形势。应该一方面加强管理，合理应用抗生素，抑制金属酶产生，阻断金属酶在不同细菌间传播;另一方面提供准确快速的金属酶检测结果，使之规范化、标准化，也便于监控金属酶的产生，防止产酶细菌的暴发和流行。由此看来，检测金属酶对临床、微生物实验室和药物开发都具有重要意义。

[1]Walsh TR，Toleman MA ，Poirel L，et al.Metallo-β-lactamases:the quiet before the storm[J].Clin Microbiol Rev，2005，18(2):306.

[2]赵书平，姜梅杰，田鑫，等.耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因研究[J].中华医院感染学杂志，2008，(18)11:1509.

[3]Matthew A.Wikler，Fracklin R.Cockerill，Karen Bush ，et al.CLSI document M100-S19.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testings;Nineteeth Informational Supplement[S].USA:Wayne，2009.

[4]Arakawa Y，Shibata N ，Shibayama K ，et al.Convenient test for screening metallo-β-lactamase-producing gramnegative bacteria by using thiolcompounds[J].J Clin Microbiol，2000，38:40.

[5]陶晶，张俊丽，翟婷婷，等.铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶分布及产金属酶方法比较[J].检验医学，2009，24(2):145.

[6]金辉，糜祖煌，钱小毛，等.铜绿假单胞菌耐药基因的分子流行病学研究[J].中华医院感染学杂志，2007，17(2):134.

[7]杨佰侠，徐元宏.金属β-内酰胺酶及其检测方法的研究进展[J].国际检验医学杂志，2006;27(2):164.

[8]Berges L，Rodriguez-Villalobos H，Deplano A，et a1.Prospective evaluation of imipenem/EDTA combined disc and Etest for detection of metallo-beta-1actamase-producing Pseudomonas aeruginosa[J].J Antimiemb Chemother，2007，59(4):812.

[9]马越，李景云，张新妹，等.2002年临床常见细菌耐药性监测[J].中华检验医学杂志，2004，27(1):38.

[10]曹孟淑，张德平.金属β-内酰胺酶的研究进展[J].国际呼吸杂志，2006，26(4):260.

[11]Da Silva GJ，Correia M ，Vital C ，et a1.Molecular characterization of bla(IMP-5)，a new integron-borne metallo-βlactamase gene from an Acinetobacter baumannii nosocomialisolatee in Portuga1[J].FEMS Microbiol Lett，2002，215(1):33.

[12]Toleman M A，Biedenbach D，Bennett D，et al.Genetic characterization of a nove1 metallo-β-laetamase gene，blaIMP-13，harbored by a novel Tn505l-type transposon disseminating carbapenemase genes in Europe:report from the SENTRY w orldwide antimicrobial surveillance programme[J].J Antimierob Chemother，2003，52(4):583.

[13]M endes RE ，Toleman MA ，Ribeiro J，et al.Integron carrying a novel metalln-β-lactamase gene，blaIMP-16，and a fused form of aminoglycoside-resistant gene aac(6)-30/aac(6′)-lb′report from the SENTRY Antimicrohia1 Surveillance Programme[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48(12):4693.