黑龙江省马铃薯晚疫病菌与采集年份和地理来源相关性分析

王佳楠 吕文河* 金光辉 白雅梅 李文霞

（1东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨 150030；2黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆163319；3东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨 150030）

马铃薯（SolanuMtuberosuML.）是世界第四大粮食作物，同时也是蔬菜、饲料、加工及工业原料作物（蒋敏华 等，2006）。晚疫病是危害马铃薯生产最为严重的病害之一。晚疫病菌（Phytophthora infestans）通常以无性生殖方式繁殖，当存在A1和A2两种交配型时，亦可通过有性的卵孢子进行繁殖（李汝刚 等，1997）。P. infestans具有8～10条染色体（Sansome &Brasier，1973），基因组全长约237 Mb（Tooley & Therrien，1987），GC含量约52 %。随着生物信息学的快速发展，EST-SSR标记以其开发成本较低，高效迅速等优点在植物病原菌遗传多样性研究中具有巨大的潜力。本试验在供试马铃薯晚疫病菌株均为 A1交配型的条件下，利用 21对EST-SSR引物分别对菌株与采集年份、菌株与地理来源的相关性进行了分析，以期为马铃薯抗晚疫病育种等工作提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在晚疫病菌株与采集年份相关性分析研究中，选取 2005、2006、2008年同为采自黑龙江省哈尔滨市的17份菌株（均为A1交配型）作为试验材料（表1）；在晚疫病菌株与地理来源相关性分析研究中，选取同为 2006年采集，但分别来自黑龙江省加格达奇、哈尔滨、黑河、海伦、克山、青冈、讷河、绥化8个地点共计46份菌株（均为A1交配型）作为试验材料（表2）。EST-SSR引物采用已发表的21对EST-SSR引物（王佳楠，2009）。本试验于2009年在东北农业大学农学院马铃薯研究室完成。

表1 2005、2006、2008年采自黑龙江省哈尔滨市的17份菌株

1.2 试验方法

1.2.1 EST-SSR分析 采用Pipe等（2000）的方法提取致病疫霉基因组DNA。PCR反应体系:25 ng模板 DNA，0.5 mmol·L-1dNTPs，2 μL 10×Buffer（Mg2+free），1.75 mmol·L-1MgCl2，15 pmol引物，1.2 UTaqDNA聚合酶，加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR产物用6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在恒定60 W功率下电泳约1.5 h，银染法染色。

1.2.2 数据处理 根据EST-SSR扩增产物，将有条带的个体记为1，没有的记为0，从而生成由1和0组成的原始矩阵。使用NTSYS-pc2.11a软件（Rohlf，2000），对原始矩阵用SimQual程序求简单匹配系数（simple matching coefficient），并获得遗传相似系数矩阵（similarity coefficient matrix），用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类树状图。将聚类结果转换为协表征矩阵（cophenetic matrix），用Mxcomp程序对聚类结果和相似系数矩阵之间的相关性进行Mantel检验。

表2 2006年采自黑龙江省8个地点的46份菌株

2 结果与分析

2.1 晚疫病菌株与采集年份相关性分析

利用已发表的 29对引物进行多态性筛选（王佳楠，2009），引物全部能够扩增出产物。选取能产生多态性且条带清晰的21对引物（占72.4 %）分别对菌株与采集年份、菌株与地理来源的相关性进行分析。

采用相似系数（Sm）以UPGMA法生成聚类树状图（图 1）。此外，将聚类结果转换为协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关性进行Mantel检验，结果表明两种矩阵显著相关（r=0.746 05）。由图 1可知，在相似系数为 0.87处聚类结果分为3组。其中，采于2005年的 3份菌株聚为第一类；而采于2005年的另2份菌株与采于 2006年的 4份菌株聚为第二类；采于2008年的8份菌株全部聚为第三类。据此，在相同地点采集的晚疫病菌株的聚类结果与采集年份之间具有一定的相关性。

图1 2005、2006、2008年采自黑龙江省哈尔滨市的17份菌株聚类树状图

2.2 晚疫病菌株与地理来源相关性分析

采用相似系数（Sm）以UPGMA法生成聚类树状图（图2）。此外，将聚类结果转换为协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关性进行 Mantel检验，结果表明两种矩阵显著相关（r=0.859 66）。由图2可知，在相似系数为0.89处，分类趋势比较明显。采自加格达奇、绥化、讷河的菌株在聚类图上亲缘关系较近，采自青岗除 QG06-5（1）外的菌株、采自哈尔滨除 HE-1外的菌株、采自海伦除HL06-113外的菌株在聚类图上亲缘关系也较近，但采自克山和黑河的菌株分散于各个类群，没有表现出聚类趋势，可知采自克山和黑河的菌株遗传背景较为复杂。据此，在相同年份采集的晚疫病菌株的聚类结果与地理来源之间具有一定的相关性。

图2 2006年采自黑龙江省8个地点46份菌株聚类树状图

3 结论与讨论

分子标记技术在生物多样性分析研究中具有很大的优势，Knapova和 Gisi（2002）的研究表明SSR标记适合针对晚疫病菌基因型多样性的研究。同AFLP相比，SSR技术具有位点特异的优点，这样更有利于分析马铃薯晚疫病菌的群体结构。本试验是在本实验室自行开发9对具有多态性产物的EST-SSR引物基础上，结合国外12对具有多态性产物的SSR引物，首次报道了黑龙江省马铃薯晚疫病菌与采集年份和地理来源之间的关系。但客观地讲，由于受到SSR引物数量，特别是用于开发 EST-SSR引物所需的高质量晚疫病菌EST序列数量的限制，引物数量尚不充足，需要进一步拓展SSR引物的开发策略，以期进一步丰富SSR引物的数量。

在晚疫病菌遗传多样性与采集年份相关性研究方面，本试验聚类结果表明，在相同地点采集的晚疫病菌株的聚类结果与采集年份有一定相关性。由分析结果可知，黑龙江省哈尔滨市 2008年的菌株群体结构与2005、2006年的菌株群体结构存在明显不同，即2008年菌株的群体结构发生了显著改变。其原因可能是2007年黑龙江省内罕见的干旱导致初侵染源发病情况发生变化，但具体原因尚须结合生理小种鉴定和抗药性鉴定等群体表现型研究结果综合考虑，作出更为全面的解释。

在晚疫病菌遗传多样性与菌株地理来源相关性研究方面，采自克山和黑河的菌株分散于各个类群，没有表现出聚类趋势，这种情况可能与以下两个原因有关:第一，与克山地区菌株采样的具体地点有关。来自克山地区的菌株有一少部分采自黑龙江省农业科学院克山分院的马铃薯育种田中，由于育种田中种植了部分引种材料和无性系材料，这些材料可能对晚疫病菌株存在筛选作用。第二，来自克山的另一部分菌株与来自黑河的菌株采自当地的商品薯田，由于两地种薯、商品薯的调运比较频繁，也会对当地晚疫病菌群体的遗传结构造成影响。因此，有理由认为，来自克山和黑河的菌株遗传背景比其他6个地点的菌株遗传背景复杂。本试验结果与瑞士的Knapova和Gisi（2002）的报道有所不同，Knapova和Gisi（2002）的研究结果认为用AFLP、SSR等分子标记检测的DNA多样性与菌源的地理位置等无相关性，但Knapova和Gisi同时承认，虽然SSR分子标记能检测出丰富的病菌群体结构多样性，但是只有少数的SSR基因型占统治地位，这可能与病害流行时以某些生理小种为主有关，不同地区的气候条件、主栽品种、耕作制度不同，病原菌与寄主在长期适应的过程中，适者生存，必然以某些类群为主，因此在试验结果上可能表现不出地理来源相关性。

在今后进一步的研究中，随着引物数量的不断增加，可以进一步采集来源更广泛，采集年份更多的菌株，通过分子标记技术进行聚类分析，从而更加准确地分析马铃薯晚疫病菌EST-SSR遗传多样性是否与菌株的采集年份和地理来源具有相关性。

蒋敏华，杨清，李丽，黄先群．2006．马铃薯抗晚疫病转基因研究进展．种子，25（12）:46-50.

李汝刚，伍宁丰，范云六．1997．马铃薯抗晚疫病研究进展．马铃薯杂志，11（4）:243-250.

王佳楠．2009．黑龙江省马铃薯晚疫病菌群体遗传多样性EST-SSR分析〔硕士论文〕．哈尔滨:东北农业大学.

Knapova G，Gisi U．2002．Phenotypic and genotypic structure ofPhytophthora infestanspopulations on potato and tomato in France and Switzerland．Plant Pathology，51:641-653.

Pipe N D，Azcoitia V，Shaw D S．2000．Self-fertility inPhytophthora infestans:heterokaryons segregate several phenotypes．Mycological Research，104:676-680.

Rohlf P J．2000．NTSYSpc，Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System，Version 2.1．Exeter Software，Setauket，NY，USA.

Sansome E，Brasier C M．1973．Diploidy and chromosomal structural hybridity inPhytophthora infestans．Nature，241:344-345.

Tooley P W，Therrien C D．1987．Cytophotometric determination of the nuclear DNA content of 23 Mexican and 18 non-Mexican isolates ofPhytophthora infestans．Exp Mycol，11:19-26.