紫外分光光度法测定氧氟沙星的解离常数

黄群莲，邓以平，徐绍友(1.泸州医学院附属医院药剂科，泸州市646000；.四川宝光药业股份有限公司，泸州市646100)

氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)又名氟嗪酸，是第3代喹诺酮抗菌药，由于分子结构中具有疏水性的N-甲基哌嗪环以及亲水性的嗪环，同时6位C原子上氟原子的引入，使得该药物具有良好的组织渗透性。其对革兰阳性和阴性菌、大肠杆菌、葡萄球菌和肺炎球菌均有强的抗菌活性[1]，与早期的喹诺酮类药物相比，具有抗菌谱广、抗菌活性强，低毒、高效、副作用小等特点[2]，因此临床上主要用于淋病、尿路感染、呼吸道感染以及胃肠道感染的治疗。

酸碱性是药物重要的理化性质，同时该性质与药物在体内的吸收、分布和溶解度密切相关，而解离常数(pKa)是与药物溶解度和pH值有关的理化常数，药物解离常数的测定可为在分子水平上研究药物的吸收与受体结合提供重要的信息[3]，同时也在药物新剂型和新配方的研制中具有重要的指导意义[4]。

测定解离常数的方法目前主要有电位滴定法[5]、电导率法[6]、荧光法[7]、电泳法[8]以及紫外分光光度法[9]等。由于紫外分光光度法具有操作简单、快速、精密度高、重现性好、数据处理方便等特点，特别适合于一元弱酸(碱)性药物解离常数的测定。通过对氧氟沙星在不同pH值缓冲溶液中进行紫外吸收扫描，发现在293 nm波长处存在最大紫外吸收，故本文采用紫外分光光度法测定氧氟沙星的2个解离常数。氧氟沙星的化学结构见图1。

图1 氧氟沙星的化学结构Fig 1The molecular structure of ofloxacin

1 材料

1.1 仪器

UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)；PHS-P1型酸度计(上海雷磁仪器厂)；FA2104电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)。

1.2 试药

氧氟沙星(台州市新星医药化工有限公司，批号:20100230，纯度:99.12%)；氧氟沙星标准品(中国药品生物制品检定所，批号:20891006，供含量测定用)；醋酸、醋酸钠、盐酸、三羟甲基氨基甲烷、氢氧化钠、硼砂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 氧氟沙星解离常数测定的基本原理

氧氟沙星中由于羧基与氨基的存在，因此在不同pH值的范围内应存在不同的电离形式。通过对其在不同pH值缓冲溶液中进行紫外吸收扫描，发现pH值在3.16以下，6.96～7.22及9.12以上时，其分别以酸性(AA+)、中性(AA0)和碱性(AA-)的形式存在，而在3.16～6.96和7.22～9.12则分别以酸性(AA+)和中性(AA0)、中性(AA0)和碱性(AA-)的形式共存。氧氟沙星在不同pH值溶液中的解离形式如图2所示。

图2 氧氟沙星在不同pH值溶液中的解离形式Fig 2The dissociation forms of ofloxacin in solutions with different pH values

设在25℃的环境中测定解离常数pKa，用1.0 cm的吸收池，在特定波长处测得吸光度为A，对任意pH值的缓冲溶液样品，则根据吸光度的加和原理，可得氧氟沙星在酸性(式(1))和碱性(式(2))时解离常数的计算公式:

根据公式(1)和(2)，只要测出AAA+、AAA0及不同pH值下的吸光度A，分别以lg([AAA+－A)(/A－AAA)0]或lg([AAA0－A)/(A－AAA-)]为横坐标，pH值为纵坐标作图得一直线，纵坐标上的截距就是氧氟沙星的2个解离常数pKa。

2.2 试液的制备

氧氟沙星溶液:称取0.1345 g的氧氟沙星，醋酸溶解并定容于250 mL的容量瓶中，得到浓度为1.50×10－3mol·L－1的氧氟沙星醋酸溶液。

缓冲溶液:将0.1 mol·L－1的醋酸钠与0.1 mol·L－1的盐酸或0.1 mol·L－1的醋酸按不同的比例混合，以及0.1 mol·L－1的三羟甲基氨基甲烷与0.1 mol·L－1的盐酸按不同的比例混合，制备成pH值为2.87～8.12的一系列缓冲溶液；将0.025 mol·L－1硼砂与0.1 mol·L－1的盐酸或者氢氧化钠溶液按不同比例混合，制备成pH值为8.48～10.20的一系列缓冲溶液。

2.3 测定条件的选择

分别制备2%的醋酸溶液和1.50×10－7mol·L－1(1.50×10－3mol·L－1的氧氟沙星醋酸溶液0.5 mL稀释至50 mL)的氧氟沙星醋酸溶液50 mL，分别以蒸馏水和醋酸作参比，用紫外分光光度计在200～400 nm波长范围扫描，得到醋酸和氧氟沙星的紫外吸收光谱，见图3。

从图3A可以看出，醋酸在288 nm波长处为醋酸酯羰基的最大紫外吸收，而约在285 nm波长以上则无紫外吸收，在205 nm波长处的强吸收为溶剂水的羟基吸收。对比图3B可以看出，在293.5 nm波长处氧氟沙星有1个明显的最大紫外吸收，这是氧氟沙星的分子结构中α，β-不饱和羰基的紫外吸收；同时氧氟沙星溶液在330 nm波长左右有1个弱吸收，这是氧氟沙星分子结构中的苯环与α，β-不饱和羰基中的双键共轭所引起的弱紫外吸收；而265 nm波长以下为醋酸酯羰基所引起的紫外吸收，对氧氟沙星在293.5 nm波长处的最大紫外吸收没有影响。因此选择醋酸作为氧氟沙星的溶剂，不影响其测定结果。

2.4 含量测定方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备。根据《中国药典》2005年版二部附录中“药品质量标准分析方法验证指导原则”，取氧氟沙星标准品，精密称定，用醋酸溶解制备成2.5013、3.7855、5.0152、6.3245、7.5866、8.8542、10.1106 μg·mL－1的氧氟沙星醋酸溶液，在293.5 nm波长处测得吸光度分别为0.232、0.341、0.446、0.552、0.672、0.774、0.882。以各梯度溶液浓度(C，μg·mL－1)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，进行线性回归，回归方程:A＝0.0856C+0.0168(R2＝0.9998)，表明氧氟沙星检测浓度线性范围为2.5013～10.1106 μg·mL－1。

2.4.2 精密度试验。取氧氟沙星醋酸溶液(3.7855 μg·mL－1)，重复测定其吸光度6次，其RSD＝0.22%(n＝6)。

2.4.3 稳定性试验。取氧氟沙星醋酸溶液(3.7855 μg·mL－1)，分别在0、2、4、8、16、24 h测定其吸光度，结果其RSD＝1.21%(n＝6)，表明溶液在24 h内基本稳定。

2.4.4 加样回收率试验。取已知氧氟沙星含量的样品的醋酸溶液50 mL，共6份，分别在其中精密加入一定量的氧氟沙星标准品，依法测定，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab 1Results of recovery test

2.5 氧氟沙星pKa的粗测

在25℃的条件下，将氧氟沙星与盐酸按照1∶1的摩尔比例混合，在水中反应完全后制备成1.50×10－5mol·L－1的氧氟沙星溶液，由于反应完全后[AA+]＝[AA0]，此时pKa1≈pH；同理，将氧氟沙星与氢氧化钠按照1∶1的摩尔比例混合，在水中反应制备成1.50×10－5mol·L－1的氧氟沙星溶液，由于反应完全后[AA0]＝[AA-]，此时pKa2≈pH。分别用酸度计测得以上2个反应液的pH值，即得氧氟沙星粗测的pKa值，粗测得pKa1＝5.68，pKa2＝8.32。

2.6 氧氟沙星pKa1、pKa2的作图计算

取16只50 mL的容量瓶，各加入1.50×10－3mol·L－1的氧氟沙星醋酸溶液0.5 mL，分别用不同pH值(2.87、3.16、4.48、4.98、5.62、6.15、6.86、6.96、7.22、7.72、8.12、8.68、8.90、9.20、9.32、10.20)的缓冲溶液定容及作参比，在25℃的室温下于293.5 nm波长处测定不同pH值下氧氟沙星溶液的吸光度，每个样品平行测定3次，取其平均值，结果见表2。

表2 氧氟沙星在不同pH值缓冲溶液中的吸光度(25℃)Tab 2The absorbance values of ofloxacin in buffer solutions with different pH values(25℃)

从表2可以看出，氧氟沙星的吸光度与缓冲溶液的pH值有关。相同浓度的氧氟沙星在pH 6.86以下的溶液中，随着pH值的增大，吸光度逐渐减小，这是因为紫外光谱与n电子和π电子的跃迁有关。当pH值增大时，即氧氟沙星的羧基电离后，使得羧基中氧上的n电子与π电子的共轭程度增加，降低了n电子和π电子跃迁的几率，使得吸收强度减小，因此吸光度降低。相同浓度的氧氟沙星在pH 7.22以上的溶液中，吸光度随着pH值增大而增大，由于在高pH值下分子中的叔胺基电离出的H+离子被碱中和后，羧基与碱中的阳离子成盐后，相反降低了羧基中氧上的n电子与π电子的共轭程度，因此增加了n电子和π电子跃迁的几率，使得吸收强度增加，导致吸光度增大。

从表2中还可以看出，在pH值小于3.16的缓冲溶液中，吸光度恒定，即氧氟沙星全部以质子化(即AA+)的形式存在，此时AAA+＝0.496；pH值在6.96～7.22之间时主要以氧氟沙星分子(即AA0)形式存在，此时AAA0＝0.409；pH值大于9.32时全部以完全去质子化(即AA-)的形式存在，此时AAA-＝0.512。根据式(1)和(2)，在不同pH值下分别以lg[(AAA+－A)/(A－AAA0)]和lg[(AAA0－A)/(A－AAA-)]为横坐标(用x表示)，pH值为纵坐标(用y表示)作图，见图4。

通过作图得氧氟沙星在酸、碱性缓冲溶液中的线性方程分别为y＝2.0796x+5.7677(R2＝0.9902)、y＝0.8008x+8.4359(R2＝0.9932)。相关系数R2分别为0.9902和0.9932，表明线性拟合后近似于直线；由截距可知，氧氟沙星的解离常数pKa1约为5.77、pKa2约为8.44，与粗测值相比，相对误差分别为1.56%和1.44%。

3 讨论

氧氟沙星在水中溶解度较差，需成盐后才溶解。本文以醋酸作溶剂，用紫外分光光度计测得氧氟沙星在293.5 nm波长处有最大紫外吸收，而在265 nm波长以下，醋酸对氧氟沙星的最大吸收没有影响，因此选择293.5 nm的波长作为氧氟沙星定性定量分析的测定波长。

通过作图法求得氧氟沙星的2个解离常数:pKa1为5.77，pKa2为8.44。对解离常数的测定，关键是选择适宜pH值范围的缓冲溶液，以保证测定结果的准确性和可靠性。

综上所述，该方法简便、快速，结果准确、可靠。氧氟沙星2个解离常数的测定对进一步研究其在生物体内的吸收、分布、代谢、排泄的规律以及对该药物的制备工艺的筛选、制剂分析等方面提供了基础性的理论研究数据。

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