重组人生长激素对大鼠胆道梗阻-再通的防治作用

齐庆安，祝建勇，王锦波

梗阻性黄疸（obstructive jaundice，OJ）是临床上各种原因引起的肝外胆管阻塞后所发生的胆汁瘀积症，由于胆汁瘀积，常可导致复杂而严重的全身性病理生理改变。传统的围手术期治疗方法疗效欠佳，而重组人生长激素（recombinant human growth hormone，rhGH）在OJ时对肝损害的防治作用的研究报道很少。本研究采用胆道梗阻-再通大鼠模型，观察应用重组人生长激素后动物血生化和血清TNF-α的变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 6～8周龄Spragure-Dawley大鼠，雌雄不限，体重180～220 g，随机将大鼠分为3组。A组：假手术组（sham operation），只游离出胆总管但不结扎，7 d后再次开腹分离粘连后关腹；B组：胆道梗阻（common bile duct ligation，CBDL）-再通（bile duct reconstruction，BDR）组，开腹游离出胆总管，3-0号丝线双重结扎，术后第7天再次开腹，行内引流术，同时，从术后第1天开始，每日皮下注射等体积的0.9%NaCl；C组：胆道梗阻-再通-rhGH注射组，手术方式同B组，从术后第1天开始，给予rhGH（瑞士Serono大药厂生产Saizen，4U/支）0.5U/kg皮下注射，1次/d，直至动物被处死。分别在A、B、C 组大鼠第一次手术后 1、3、7、10、14 d 5 个时相点（每个时相点保证有6只动物），于下腔静脉穿刺取血4～5 ml，4℃，3 000×g 离心 15 min，取上清置于-70℃冰箱保存待测。采血后，经门静脉灌注0.9%NaCl注射液冲去血液，取肝组织，在10%甲醛水溶液中固定12～24 h再修剪成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm组织块；另在3%戊二醛水溶液中修剪成0.5mm×0.5mm×0.5 mm的组织块，固定2～4 h，备电镜检查。

1.2 生化检测 采用北京中山公司提供的谷丙转氨酶检测试剂盒（赖氏法）检测ALT的变化，总胆红素检测试剂盒（重氮法）检测TBIL的变化，采用上海长征医学科技有限公司提供的总胆汁酸检测试剂盒（循环酶法）检测TBA的变化，采用解放军总医院科技开发中心放免所提供的肿瘤坏死因子α检测试剂盒（放免法）检测TNF-α的变化。

1.3 统计学处理 计数资料采用χ2检验。计量资料求出±s，应用SPSS 11.5软件进行统计学分析，组间均数的比较采用双因素方差分析。

2 结 果

2.1 SD大鼠术后一般情况 B组术后7 d存活率为88.0%（88/100），死亡的12只动物中因麻醉意外死亡1只，胆漏2只，全身衰竭9只；胆道再通术后7 d存活率为69.2%（36/52），死亡的16只中麻醉意外3只，全身衰竭4只，出血4只，术后胆漏继发腹腔内感染5只。B组术后14 d大鼠累积死亡率为41.9%（13/31），与C组的累积死亡率14.3%（3/21）相比，具有统计学差异（P<0.05）。

2.2 血清ALT、TBIL及TBA水平变化 B、C组CBDL术后 ALT、TBIL、TBA 水平显著升高（P<0.01），BDR术后上述指标逐步好转，至术后14 d时接近但仍显著高于A组水平（P<0.05）；给予rhGH的C组大鼠各项指标的改善明显优于0.9%NaCl注射的B组，随用药天数的增加，效果更趋明显，特别是在术后14 d ALT水平已回落至A组水平，并显著低于B组（P<0.05）。

2.3 血清TNF-α的水平变化 B、C组CBDL术后TNF-α浓度上升，随梗阻时间的延长，与A组逐渐出现非常显著的差异（P<0.01）。BDR术后TNF-α逐渐下降，C组下降更为显著（P<0.05），于术后7 d达到A组水平，且与B组具有统计学差异（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠术后不同时间血清TNF-α水平（ng/ml，±s）

表1 各组大鼠术后不同时间血清TNF-α水平（ng/ml，±s）

与 A 组比较，*P<0.05，**P<0.01；与 B 组比较，#P<0.05，##P<0.01

时相点 A组 B组 C组术后 1 d 0.95±0.19 1.23±0.38* 1.26±0.40*术后 3 d 0.89±0.15 1.46±0.48* 1.34±0.48*术后 7 d 0.94±0.17 4.14±0.70** 3.83±0.63**#术后 10 d 0.92±0.18 3.23±0.71** 1.67±0.21*##术后 14 d 0.96±0.19 1.38±0.29* 0.93±0.15#

2.4 胆道梗阻-再通术后肝脏病理形态学改变 A组大鼠呈正常肝小叶结构。B、C组大鼠CBDL术后肝小叶结构尚完整，肝细胞淤胆，中央静脉周围肝细胞内可见无折光性、棕褐色胆色素颗粒沉积，随梗阻时间的延长，肝细胞内色素颗粒增大更加显著，部分肝细胞浊肿变性、坏死，部分肝细胞脂肪变性。汇管区明显炎性细胞浸润，小胆管增生，胆栓形成（图1）。胆道再通术后，汇管区仍有较多炎性细胞浸润，肝细胞坏死少见，总体上解除梗阻后病理改变明显减轻（图2）。

透射电镜观察显示，A组肝细胞形态正常。B、C组CBDL术后肝细胞胞质疏松，核圆缩，线粒体明显肿胀，嵴断裂、减少，基质透明性变，以致线粒体呈空泡状，内质网扩张，毛细胆管管径增加（图3）。BDR术后肝细胞线粒体仍显著肿胀，微绒毛数量增加，毛细胆管腔内可见散在微绒毛膜泡。C组肝细胞线粒体肿胀、毛细胆管扩张以及单位面积微绒毛数量减少均较B组减轻，至术后14d时，肝细胞及毛细胆管形态恢复较好，微绒毛数量明显增加（图4）。

图1 CBDL术后7 d肝组织学改变（HE×400）汇管区见中性粒细胞浸润，小胆管增生

图2 BDR术后7 d肝组织学改变（HE×400）肝细胞排列紊乱，细胞质疏松，汇管区见中性粒细胞浸润，小胆管增生，肝细胞坏死减少

图3 B组胆道梗阻术后7 d超微结构改变（×10 000）肝细胞线粒体肿胀，基质密度减低呈空泡状，嵴断裂减少

图4 C组胆道再通术后7 d超微结构改变（×7 000）肝细胞线粒体肿胀减轻，基质密度稍低

3 讨 论

梗阻性黄疸是临床上常见的疾病，患者术后容易发生急性胃黏膜病变、急性肾功能衰竭、免疫功能障碍乃至全身炎症反应综合征、凝血机制紊乱甚至弥散性血管内凝血等严重并发症，病死率亦居高不下。生长激素是脑垂体前叶分泌的一种蛋白质，由191个氨基酸残基组成的多肽，其主要作用是促进生长发育和影响代谢，既往主要用于儿童生长激素缺乏症的治疗，近年来随着临床研究的深入，发现生长激素具有促进肝细胞、胃肠黏膜上皮细胞、烧伤后残存上皮细胞和软骨细胞等多种细胞增殖的能力[1]。目前已经在肠瘘、慢性消耗性疾病及全胃肠外营养支持治疗中得到广泛应用，但在梗阻性黄疸中的研究尚缺乏[2～4]。

梗阻性黄疸常伴随内毒素血症，而TNF-α是其毒性的主要执行者。TNF-α可激活细胞因子的级联反应，诱发白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、 血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、前列腺素和白三烯等的分泌，激发炎症连锁反应，导致所谓 “瀑布效应”[5～7]。 本文结果显示，TNF-α在CBDL术后1d即有明显上升（P<0.05），并随梗阻时间的延长而逐步升高，与假手术组逐渐出现非常显著的差异（P<0.01），至术后第7天时B组TNF-α的水平为A组的4.4倍；同时其对肝脏的负面影响也逐渐加重，表现为ALT、TBIL、TBA的显著升高，至术后第7天时分别增高为A组的3.2、34.3、18.4倍。rhGH的应用降低了梗阻性黄疸时大鼠血清的TNF-α水平，减轻了肝组织损害，但直至术后第7天始显著低于B组（P<0.05）。与此同时，rhGH部分改善了胆道再通术前大鼠的肝功能，血清 ALT、TBIL、TBA 水平均显著低于 B 组（P<0.05），尤其后者更为显著（P<0.01）。王向昱等[8]通过皮下注射rhGH治疗重症急性胰腺炎患者40例，亦发现rhGH能显著降低急性坏死性胰腺炎胃肠黏膜组织炎性细胞因子、粘附分子与趋化因子的转录，从而发挥其胃肠道局部抗炎作用。笔者认为，此种“有益效应”主要与rhGH能保护肠黏膜屏障，减少细菌移位和内毒素吸收等有关。然而，rhGH并不能扭转OJ时严重的病理生理改变，C组大鼠肝功能仍呈持续恶化趋势，说明解除胆道梗阻是首要因素。梗阻解除后，C组大鼠肝功能指标以及TNF-α水平明显低于同时相点的B组大鼠（P<0.05），至术后第14天时虽然TBIL与TBA仍显著高于A组，但是ALT与TNF-α已恢复为正常水平，说明rhGH能促进OJ大鼠在BDR术后的恢复。

本实验还发现，在52只行BDR手术的OJ大鼠中，有13只术前一般情况很差，黄疸严重，BDR术后7d内死亡8只，死亡率高达61.5%，占全部术后死亡的50.0%（8/16），且大多数是未应用rhGH的B组大鼠（6/8），说明在影响OJ大鼠手术危险性的因素中，TBIL以及TBA是重要的参考指标，而rhGH能显著降低OJ大鼠在胆道再通术前的TBIL、TBA水平，并显著降低术后第14天大鼠累积死亡率（P<0.05），说明rhGH能增强OJ大鼠的手术耐受性、提高安全性。Ram等[9]认为rhGH可能通过JAK/STAT5通路上调淤胆时钠-牛磺胆酸盐共转运多肽（Na+-dependent taurocholate cotransporting polypeptide，Ntcp)的表达，从而起到“利胆”作用，但 rhGH对其它转运子，特别是对肝细胞毛细胆管面转运子的调节机制尚不清楚。

此外，笔者曾对重度OJ和淤胆性肝炎患者在用常规治疗无法使黄疸减轻时，试用过rhGH治疗，发现其具有较明显的“利胆”作用。Sklar等[10]通过361例恶性肿瘤幸存患者接受rhGH治疗后肿瘤复发情况的研究发现，肿瘤的复发率仅为0.83%，继发性肿瘤的发生率为3.21%，rhGH治疗与患者的病死率也没有明显联系。因此，对于长期重度OJ，在解除梗阻的原则下，rhGH“利胆”、改善肝功能的作用可用于部分重症患者的围手术期处理。

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