肌苷氯化钠注射液鲎试剂细菌内毒素检查法

张 萍，张 莉，于燕莉

肌苷氯化钠注射液属辅酶类药,具有改善机体代谢的作用。临床用于各种类型的肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等。中华人民共和国国家药品监督管理局标准规定其热原检查为家兔法[1]，用鲎试剂检查肌苷氯化钠注射液细菌内毒素目前尚未见报道。为了提高其热原检查的快速性，有效性和灵敏度，本文参照中国药典2005年版中细菌内毒素检查法中的有关规定及相关文献，对该品种进行了细菌内毒素的检查法的可行性研究，报告如下。

1 实验材料

1.1 试剂 细菌内毒素工作标准品（CSE，中国生物制品检定所，70 EU/ml，批号 070121）。 鲎试剂（TAL，厦门鲎试剂厂，

批号 080120，标示灵敏度 0.25 EU/ml，0.1 ml/支；湛江海洋生物制品厂，批号 080319，灵敏度 0.25 EU/ml，0.1 ml/支）。 细菌内毒素检查用水（BET水，湛江海洋生物制品厂，批号070914，2 ml/支，内毒素含量＜0.03 EU/ml；肌苷氯化钠注射液500 mg/100 ml（山东鲁抗辰欣药业有限公司批号：20070407，20070612，20070918）。

1.2 实验材料、器皿 自动旋涡混合器：天津药典标准仪器厂；DC-3型干式恒温器：南京三爱斯技术有限开发公司；试管、吸管等所需器皿均经250℃ 1h除去外源性内毒素。

2 方法与结果

2.1 TAL灵敏度复核试验 按中国药典2000年版附录细菌内毒素检查法[1]进行操作，复核灵敏度 λc为 0.5～2.0 λ，表明试验用二个生产厂家的二批鲎试剂灵敏度标示符合规定。结果见表1。

2.2 供试品的干扰初筛试验

2.2.1 供试品细菌内毒素理论限值（L）的确立[1]按公式L=K/M，内毒素致热阈K为按规定的给药途径，人用kg体重每h最大可接受的细菌内毒素剂量，注射剂K值为5 EU/kg·h；M为人用每kg体重每h的最大剂量，人增体重按60 kg计算。根据肌苷氯化钠注射液最大剂量为100 ml/60 kg·h，则细菌内毒素理论限值：L=K/M=5/（100/60）=3.0 EU/ml。

2.2.2 样品最大有效稀释倍数（MVD）的确立[1]按公式MVD=CL/λ 计算，则 MVD=1×3/0.25=12（倍）。

2.2.3 预干扰试验[2]用BET水分别将供试品溶液按照原液→1∶2→1∶4稀释。同时，用此系列浓度的样品溶液稀释细胞内毒素分别取不同稀释度的供试品溶液将70 EU/mlCSE按 70 EU/ml→10 EU/ml→1.0 EU/ml，→0.5 EU/ml，→0.25 EU/ml→0.125 EU/ml→0.0625 EU/ml进行稀释，配制成含有不同稀释浓度样品的相应内毒素管。取内毒素含量为0.5 EU/ml，0.0625 EU/ml各稀释浓度的上述溶液各0.1 ml，分别加入已复溶的0.1 ml TAL安瓿中，进行预试验，每一浓度平行做2管；另取0.1 ml内毒素检查用水加入已复溶的0.1 mlTAL安瓿中，作阴性对照，恒温（37±1） ℃，保温（60±2）min。 由表2的结果表明：原液2 λ全为阳性，1/4 λ全为阴性，阴性对照（NC）为阴性，阳性对照(PC)为阳性。说明注射液原液对鲎试剂反应无干扰，不需稀释即可作为正式试验的样品[3]。

表1 鲎试剂的灵敏度复核试验

表2 肌苷氯化钠注射液预干预试验结果

2.3 干扰试验 预试验表明，样品原溶液对细菌内毒不存在抑制或增敏作用，样品不需稀释即可用于试验，但仍需进一步作干扰验证。将三批批号的肌苷氯化钠原液将70 EU/ml的CSE 稀释制得 0.5、0.25、0.125、0.0625 EU/ml系列内毒素浓度溶液，各取0.1 ml加入0.1 ml BET水复溶的TAL安瓿中，每一浓度平行做4管。另取0.1 ml细菌内毒素检查用水和样品原液加入上述CSE安瓿中，各平行做2管，作为阴性对照，恒温（37±1） ℃，保温（60±2） min，观察结果。

2.4 结果 依据中国药典2005年版规定：用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度几何平均值Es和用供试品溶液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度几何平均值Et。

Xs、Xt分别为BET水和供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值。

当 Es 值在 0.5～2.0 λ，Et在 0.5～2.0 Es，可以认为供试品溶液在该浓度下对TAL不存在干扰。根据表3、4试验数据说明三批肌苷氯化钠注射液在不需要稀释的情况下，对细菌内毒素检测均无干扰，在进行该品种的细菌内毒素检查时可选用的鲎试剂灵敏度为0.25 EU/ml。计算结果见表5。

表3 肌苷氯化钠注射液干预试验结果

表4 肌苷氯化钠注射液干预试验结果

表5 干扰试验计算结果

3 讨 论

本实验采用3个批号的肌苷氯化钠注射液分别用两个不同厂家的鲎试剂进行干扰试验。结果显示样品原液对鲎试剂不存在干扰作用。以上三批样品，均经热原检测（家兔法）合格，同时，用细菌内毒素检查法，样品不需稀释，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml时测定结果为阴性，干扰试验结果符合要求。说明用细菌内毒素检查法可替代热原检查法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）.北京:化学工业出版社,2005.附录 P86,204.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范.北京:中国医药科技出版社,2001.389.

[3]黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志,1997,32(2)：72.

[4]中华人民共和国国家药品监督管理局.国家药品标准.WS-1061(X-796)-2002.