JAK2-STAT3通路介导缺血后处理心肌保护作用的初步研究*

夏大川 田轶魁 吴志浩 魏民新

在长时间缺血期后的再灌注早期进行短暂的、间歇性的缺血和再灌注，即缺血后处理，可以产生和缺血预处理类似的心肌保护作用[1]。缺血后处理可有效缩小心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡，减轻心肌顿抑，加快心肌功能恢复，降低再灌注早期心律失常的发生。目前关于缺血后处理心肌保护作用的机制尚不明确。JAK-STAT通路是近年来新发现的一条细胞内信号传导途径，其可将细胞外信号传递到细胞核，进而调节细胞核内转录引发生物学效应[2]。研究表明JAK2-STAT3通路在缺血预处理心肌保护作用中具有重要作用[3-4]。本研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，观察JAK2-STAT3通路在缺血后处理心肌保护中的作用。

1 材料与方法

1．1 材料 健康雄性Wistar大鼠36只，体质量230～280 g，购自天津医科大学实验动物中心。红四氮唑（2，3，5－triphenyltetrazolium，TTC）购自中国医药上海化学试剂公司，伊文思兰（Evans blue，EB）购自中国医药上海化学试剂公司，用生理盐水配成2%的浓度备用。Ag490（JAK2－STAT3通路阻断剂）购自sigma公司，TUNEL法细胞凋亡检测试验盒购自武汉博士德生物工程有限公司。数码相机，计算机图像分析系统，小动物呼吸机，小动物心电图仪。

1．2 实验方法

1．2．1 动物模型及分组 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mg/g）麻醉并固定于实验台上，气管插管连接小动物呼吸机。在大鼠四肢皮下及胸前插入针性电极，连接小动物心电图仪。左侧第四肋间开胸，剪开心包膜，充分暴露心脏。以6-0无损伤线在左冠状动脉前降支分支下约3 mm处穿一结扎线，已备结扎。结扎时采用直径0.2 cm的细塑料管穿过结扎线用止血钳夹紧。心电图Ⅱ导联出现ST段弓背抬高为结扎成功。模型建立成功后大鼠随机分为3组，每组12只，其中6只检测心肌梗死面积，6只检测心肌细胞凋亡。缺血再灌注（I－R）组：缺血30 min，再灌注120 min。缺血后处理（Post）组：缺血30 min，再灌注120 min，并于再灌注前实施缺血后处理（灌注10 s，缺血10 s）3个循环。缺血后处理＋AG490（Post＋AG490）组：缺血30 min，再灌注120 min，再灌注前实施缺血后处理3个循环，并于再灌注前5 min静脉注射AG490（3 μg/g）。

1．2．2 标本采集 心肌再灌注120 min后，结扎线打结，静脉注射2%伊文思兰1 mL，迅速取出大鼠心脏置于－20℃冰箱快速冷冻，用于检测心肌梗死面积；心肌再灌注120 min后，取左室心尖部全层心肌标本，用中性福尔马林固定，用于检测心肌细胞凋亡。

1．2．3 心肌梗死面积测定 自心尖向心底将左室切成厚2 mm的切片。在切片中，蓝染区域为非缺血区，非蓝染区为危险区；梗死心肌呈灰白色，非梗死心肌呈砖红色。将所有切片置于2%TTC中，37℃避光孵育30 min，然后用生理盐水冲去游离染料，10%甲醛固定。用计算机图像分析系统计算左室总面积（LV）、危险区面积(area at risk，AAR)及梗死面积（infarct size）。以AAR/LV表示心肌缺血程度，infarct size/AAR表示心肌梗死程度。

1．2．4 心肌细胞凋亡指数测定 心肌标本固定后常规石蜡包埋和切片，用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）测定心肌细胞凋亡指数。具体方法为：将石蜡切片脱蜡、水化，在PBS（0.01 mmol/L,pH7.4）中孵育8 min，加入蛋白酶溶液于37℃孵育60 min，再加入0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液200 μL，350 W微波照射5 min后PBS振洗2次，每次5 min，配置TUNEL反应液，冰上保存。将切片再次用PBS振洗2次，每次5 min后滴加50 μL TUNEL反应液，37℃暗室孵育60 min，加PBS，荧光显微镜下观察染色，加50 μL POD溶液，37℃湿化孵育60 min，再用PBS洗3次，每次5 min。滴加DAB底物显色。显色后用甲基绿复染，然后脱水封片。每张切片随机取6个高倍镜视野，检测每个高倍镜视野下调亡细胞核数和总细胞核数。凋亡指数为100个细胞核中凋亡细胞核的个数。

1．3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计分析软件进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示。多组比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 3组心肌梗死面积比较3组AAR/LV差异无统计学意义。Post组infarct size/AAR低于I-R组和Post＋AG490组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 3组心肌梗死面积比较 （n=6，%±s）

表1 3组心肌梗死面积比较 （n=6，%±s）

*P＜0．05

I-R组（1）Post组（2）Post+AG490组（3）F 44.0±4.4 48.0±3.1 44.0±3.8 1.392 58.0±5.3 37.0±3.7 55.0±3.8 41.741*组比（1）∶（2）（2）∶（3）（1）∶（3）q 3.46*3.12*0.52统计学处理组别AAR/LVinfarct size/AAR

2.2 3组心肌细胞凋亡指数比较3组心肌细胞凋亡指数差异有统计学意义（F=374.35，P＜0.05）。Post组的心肌细胞凋亡指数（40±4）低于I-R组（73±6）和Post＋AG490组（71±3），差异均有统计学意义（q分别为34.47和32.38，均P＜0.05）。

3 讨论

缺血后处理是由Zhao等[1]于2003年提出，他发现在心肌缺血结束后再灌注时先给予多次短暂停灌、复灌处理，具有与缺血预处理相似的心脏保护作用。因再灌注具有可预知性和可控制性的特点，且操作简单方便，故缺血后处理具有更直接的临床应用价值[5-6]。研究发现，缺血后处理可以刺激心肌细胞产生多种内源性物质，通过心肌细胞内多种信号传导通路，抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤[7]。本实验结果显示，缺血后处理可以显著降低再灌注120 min后心肌梗死面积并减少心肌细胞凋亡指数。可见，缺血后处理具有强大的心肌保护作用。

多年来对于缺血后处理的机制研究发现，细胞内信号传导通路在其心肌保护作用中具有重要地位。Tsang等[7]的研究发现缺血后处理心肌保护作用主要通过再灌注损伤存活激酶（RISK）途径来实现，而PI3K/Akt通路是该途径的关键酶。JAK-STAT通路主要由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族组成，其中JAK是STAT的上游共有激酶，它广泛参与了细胞应激、生长、增殖、分化和调亡等多种生物学效应。缺血预处理可以激活JAK2-STAT3通路，上调24 h后COX-2及iNOS等保护蛋白，发挥延期保护作用[8]。Kerstin等[9]在小鼠的实验中发现STAT3在缺血后处理心肌保护作用中发挥重要作用。本研究结果显示再灌注前5 min静脉注射AG490使缺血后处理的心肌保护作用消失，证实了缺血后处理心肌保护作用与JAK2-STAT3通路关系密切。

缺血再灌注损伤的许多重要机制都是发生在再灌注开始阶段。缺血后处理的保护作用是通过激活再灌注开始阶段心肌内源性保护机制，抑制损伤机制发挥作用。本研究的结果显示JAK2-STAT3通路在这一过程中发挥了重要作用。近年来有研究发现，缺血后处理具有长期心肌保护作用[10]。而缺血后处理长期保护作用的分子机制及是否与JAK2-STAT3通路有关有待于进一步研究。

[1]Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et a1．Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,286(1):H477.

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