1，25-二羟维生素D3对猪成釉细胞釉原蛋白和成釉蛋白分泌的影响*

曾宪莉，赵红宇，轩东英，赵 华，王春先，周东风，章锦才

1)郑州大学口腔医学院郑州450052 2)南方医科大学附属口腔医院;广东省口腔医院番禺分院番禺511400 3)南方医科大学附属口腔医院;广东省口腔医院广州510280

随着医学分子生物学和组织工程学的发展，模拟牙釉质的矿化过程，生产出具有再矿化能力的生物义齿成为国内外研究的热点。釉原蛋白(amelogenin，AMEL)是釉质有机基质的主体，为釉质生物矿化提供必要的支架。非釉原蛋白包括釉蛋白和成釉蛋白(ameloblastin，AMBN)等也被认为具有较广泛的促进晶体成核和影响晶体生长形态的作用［1］。1，25-二羟维生素 D3［1，25-(OH)2D3］作为维生素 D甾体类激素的活化形式，对细胞生长、分化及蛋白质的分泌等起着重要的调控作用［2-3］，其受体在口腔组织中分布广泛，其中成釉细胞是维生素D的靶细胞之一［4-5］。作者拟通过体外培养猪成釉细胞，应用Western blot法检测不同浓度1，25-(OH)2D3对猪成釉细胞所分泌的特异性蛋白AMEL和AMBN的影响，为牙釉质生物矿化的研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青、链霉素 (美国Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)、ABC型免疫组化检测试剂盒、鼠抗人波形丝蛋白多克隆抗体和鼠抗人角蛋白多克隆抗体(美国博士德公司)，1，25-(OH)2D3和兔抗人AMEL多克隆抗体(美国 Sigma公司)，羊抗猪AMBN单克隆抗体、鼠抗猪β-actin单克隆抗体和Brandford蛋白定量试剂盒(美国Santa Cruz公司)。

1.2 猪成釉细胞的培养及鉴定 选择约6个月龄30 kg体质量的西藏小型猪(购自南方医科大学动物中心)注射过量氯胺酮处死后消毒，取上下颌骨，于无菌条件下切开牙槽黏膜，去除颊侧牙槽骨，分离取出磨牙牙胚，置于pH 7.2的PBS中2 h。PBS冲洗3次，分离牙囊、牙乳头及成釉器。将成釉器组织剪碎成1 mm3大小的组织块，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入少量含体积分数10%FBS，青、链霉素各100 kU/L和体积分数1%L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养液，吹打均匀，组织块法接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中进行原代培养，每3 d换液1次，待细胞生长至90%融合时传代。传代后制作细胞爬片，镜下观察细胞形态，并行间接法免疫细胞化学染色，镜下观察AMEL、角蛋白、波形丝蛋白的表达。

1.3 实验分组 将1，25-(OH)2D3用含体积分数1%FBS的DMEM/F12培养液稀释至所需浓度(1×10－10、1 × 10－8和 1 × 10－6mol/L)，以含体积分数1%FBS的DMEM/F12培养液作对照。取第2代猪成釉细胞以1×106mL－1的密度接种至12个75 cm2培养瓶中常规培养24 h，待细胞贴壁后，用无血清的DMEM/F12洗1次，分4组，分别加入上述配制好的培养液继续培养，每组3瓶。

1.4 猪成釉细胞AMEL和AMBN的检测 采用Western blot法。各组分别在加药后1、3及5 d取出1瓶样本，用含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂提取猪成釉细胞总蛋白，用Brandford蛋白质定量试剂盒测定样品浓度。对提取的总蛋白行SDS-PAGE电泳，以检测AMEL和AMBN的表达变化，β-actin作为内参。30 mA恒流条件下，4℃转移过夜。膜在体积分数5%BSA溶液中室温孵育1 h，加入一抗(AMEL和AMBN一抗工作浓度均为1∶100)室温孵育1.5 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，化学发光法检测。图片用Quantity One分析软件(芬兰Biohit公司)处理，以目的蛋白条带的灰度值与内参β-actin的灰度值的比值代表目的蛋白的相对含量，实验重复4次。

1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0进行分析，各组间蛋白质相对含量的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 猪成釉细胞的鉴定结果 猪成釉细胞呈上皮细胞样，细胞形态多样，呈圆形或多角形。免疫细胞化学染色结果显示，猪成釉细胞角蛋白染色阳性(胞质呈棕黄色)，而波形丝蛋白染色阳性(胞质无着色)，表明该细胞为上皮来源;AMEL抗体染色阳性(胞质呈棕黄着色)，表明该细胞为成釉细胞，见图1。

图1 猪成釉细胞形态及免疫细胞化学染色结果(×400)

2.2 猪成釉细胞分泌AMEL和AMBN的相对含 量 见图2和表1、2。

图2 各组不同时间点猪成釉细胞分泌的AMEL(左)及AMBN(右)

表1 各组不同时间点猪成釉细胞分泌AMEL的相对含量

表2 各组不同时间点猪成釉细胞分泌AMBN的相对含量

3 讨论

成釉细胞是具有特殊功能的终末分化细胞，能分泌多种细胞外基质蛋白，调节釉质基质的形成和矿化［6］。研究［7-8］发现维生素D受体在口腔组织中分布广泛，成釉细胞和成牙本质细胞是维生素D的靶细胞。

AMEL和AMBN是釉质生物矿化的关键蛋白，1999 年 Papagerakis等［9］发现 AMEL 的表达受1，25-(OH)2D3调控，这是对激素调控牙齿特定基因表达的首次报道。2002年Papagerakis等［10］的研究结果表明，几种蛋白协同作用形成牙齿的过程可能受1，25-(OH)2D3的调控。

作者的研究结果显示:不同浓度的 1，25-(OH)2D3作用后，猪成釉细胞AMEL的分泌量随作用时间的延长和药物浓度的增加而增加，AMBN的分泌量随作用时间的延长而增加，随药物浓度的增加而减少。提示1，25-(OH)2D3是一种生物诱导分化剂，它通过促进成釉细胞AMEL的分泌和抑制成釉细胞AMEN的分泌，进而影响成釉细胞参与牙釉质的矿化过程。

总之，作者认为成釉细胞分泌AMEL和AMBN受1，25-(OH)2D3调控，但 1，25-(OH)2D3是通过何种信号通路影响这些蛋白的表达，需进一步探索研究。

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［10］Papagerakis P，MacDougall M，Berdal A.Differential epithelial and mesenchymal regulation of tooth-specific matrix proteins expression by 1，25-dihydroxyvitamin D3 in vivo［J］.Connect Tissue Res，2002，43(2/3):372