Th17类细胞因子在溃疡性结肠炎患者中的表达

何英 李春明 单景军 蒋萍

(黑龙江省哈尔滨市第一医院消化科,*病理科,黑龙江 哈尔滨 150010)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一类病因不明的胃肠道慢性非特异性炎症,属于自身免疫病的一种,近年来其发病率不断增加,已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要病因[1]。目前普遍认为该病发病主要由免疫反应介导,并与遗传因素、环境因素密切相关,免疫调节紊乱是本病发病的关键因素[2-3]。近年来新发现一种新的CD4+辅助T细胞亚群Th17细胞亚群,该细胞亚群主要分泌白介素-17(IL-17)[4]。目前研究[5-6]认为Th17细胞在自身免疫性疾病发病中起关键性作用。本研究检测IL-17在溃疡性结肠炎患者中的表达及其与疾病活动指数的相关性,探讨Th17细胞在UC发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 实验组选择自2008年1月—2009年10月哈尔滨市第一医院25例确诊为溃疡性结肠炎的门诊及住院患者,诊断均符合2007年《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》中的诊断标准[7]。其中男性12例,女性13例,年龄18～70岁,轻度UC患者7例,中度 UC患者14例,重度UC患者4例。对照组为10例单发性结肠或直肠息肉患者,对照组与UC组的年龄、性别构成无显著差异(P＞0.05)。

1.2 实验材料 实验组在结肠镜下选择病变最显著肠段的结肠黏膜3块活检,对照组取距单发性息肉5 cm以上的正常肠黏膜3块活检。另外实验组和对照组患者均清晨空腹取外周血。

1.3 主要试剂 IL-17ELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为武汉博士德公司产品;IL-17抗体购自Santa Cruz公司。

1.4 方法

1.4.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-17 分离血清后严格按照试剂盒说明操作,终止反应后在450 nm处读取各孔吸光度值,以各孔OD值为纵坐标,以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线,根据样品OD值查找对应的浓度。

1.4.2 免疫组化检测结肠黏膜IL-17表达 活检标本常规甲醛固定,石蜡包埋,并将石蜡块进行连续切片用于免疫组化检查。石蜡切片常规脱蜡进水,3%甲醇室温孵育以清除内源性过氧化物酶的活性,用0.01 mmol◦L-1,pH为6.0枸椽酸盐缓冲液孵育进行热抗原修复,10%正常羊血清封闭,一抗为兔抗人IL-17抗体(稀释浓度为1:100),4℃过夜,滴加生物素标记的羊抗兔二抗工作液,37℃温箱孵育20min,滴加辣根酶标记的链霉素卵白素室温孵育40min,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。每次以PBS缓冲液代替一抗作空白对照。阳性细胞为细胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒沉淀。每张切片均应用医学彩色图像分析系统进行扫描分析,每张切片随机取5个染色较好的不重复的视野,取其光密度的均值作为该切片的实验结果,留待统计分析。

1.4.3 疾病活动指数(DAI)的评估 每日让UC患者记录大便性状和隐血情况,按表1进行评分。结肠镜下黏膜外观由多名内镜医师共同经过盲法阅片,医师总体评价亦由多名临床医师共同评价,保证判断的准确性。

表1 溃疡性结肠炎患者疾病活动指数(DAI)评分

1.5 统计学处理 数据采用SPSS13.0软件包进行处理,计量资料采用均数加减标准差表示,两组间比较采用t检验,两组间相关分析采用方差分析检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ELISA法检测血清IL-17结果 25例UC外周血中 IL-17平均浓度为(13.62±2.37)ng◦mL-1,10例正常对照组外周血中IL-17平均浓度为(10.98±3.67)ng◦mL,两组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 免疫组化检测结肠黏膜IL-17表达结果 IL-17主要在结肠黏膜固有层的炎细胞(如淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞)表达,UC组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),(图1)。

图1 各组患者肠黏膜 LI-17的表达(免疫组织化学染色×100)

2.3 IL-17与疾病活动指数的相关性 按DAI评分将UC患者分成轻、中、重3组,IL-17与DAI评分呈正相关。IL-17在轻、中、重3组中的表达分别是15.31%±2.01%;35.43%±3.31%;41.98%±4.65%。轻度与中度UC患者相比,P＜0.05;中度与重度相比,P＜0.05。

3 讨 论

UC病因未明,CD4+辅助T细胞在UC发病中的作用已经得到公认[8]。传统的CD4+辅助性T细胞主要分为两个亚群:Th1细胞亚群和Th2细胞亚群。既往人们认为Th1细胞和Th2细胞失衡是造成UC发病的主要原因,但是还是有许多令人无法解释的现象。Th17细胞亚群是近几年才得到肯定的一类CD4+T细胞亚群,其分泌的主要细胞因子IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程,从而有效地介导了前炎性反应,诱导促炎细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达,引起组织细胞浸润和组织破坏。IL-17可以诱导固有免疫炎症细胞因子、急性反应蛋白、粒-巨细胞刺激因子(GCSF)和前列腺素E2等表达,还与炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等有协同作用,放大加强其致炎效应[9]。许多炎性疾病,如类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、哮喘及同种排异反应患者的病变组织中都能检测到IL-17。体内实验证明,高水平IL-17与多种自身免疫病发病机制有关[10]。本研究用免疫组化的方法检测 UC结肠黏膜IL-17的表达水平,在UC患者结肠黏膜中IL-17表达较正常人显著增加。Ogawa[11]应用抗-CD3或抗-CD68与抗-IL-17进行双重染色,发现T细胞和单核/巨噬细胞是炎症性肠疾病患者炎症局部IL-17的来源。这与IL-17的生物学特性一致,因此,可以说来源于T细胞和单核/巨噬细胞的IL-17可以诱导并维持UC黏膜炎症应答。并证实了IL-17表达与疾病活动指数呈正相关。局部IL-17浓度的高低也反映了UC的炎症严重程度。本实验未发现外周血IL-17表达增高,说明Th17细胞因子主要作用于病变局部而非全身,进一步证明了记忆性T淋巴细胞介导的免疫反应具有组织器官的靶向性[12]。而IL-17主要由记忆性T淋巴细胞产生,某一部位的IL-17升高能诱导相应部位的炎性反应,具有部位的专一性[13]。因此,通过本实验可以推测Th17细胞与UC发病有密切关系。近年来通过分子标靶技术阻断炎症、免疫途径治疗UC的理念取得了较大进展[14-15],局部阻断 Th17细胞的分泌可以成为治疗UC的一种手段。

1 Ouyang Q,T andon R,Goh KL,et al.The emergence of inflammatory bowel disease in the Asian Pacific region[J].Curr Opin Gastroenterol,2005,21:408-413.

2 Jiang Y,Xia B,Jiang L,et al.Association of CTLA-4 gene microsatellite polymorphism with ulcerative colitis in Chinese patients[J].Inflamm Bowel Dis,2006,12(5):369-373.

3 Vermeire S.Genetic susceptibility and application of genetic tes ing in clinical management of inflammative bowel disease[J].Aliment Pharmacol,2006,3:2-10.

4 Harrington LE,Mangan PR,Weaver CT.Expanding the effector CD4T-cell repertoire of the Th17 lineage[J].Curr Opin Immunol,2006,18(3):349-356.

5 Weaver C T,Harring ton LE.T h17:an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties[J].Immunity,2006,24(6):677-688.

6 Harrington LE,Mangan PR,Weaver CT.Expanding the effector CD4 T-cell repertoire:the T h17 lineage[J].Curr Opin Immunol,2006,18(3):349-356.

7 中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组.对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J].中华消化杂志,2007,27:545-550.

8 庞艳华,郑长青.Th 1/T h2细胞亚群与炎症性肠病的关系[J].世界华人消化杂志,2004,12(8):1922-1924.

9 Komiyama YS,Nakae T,M atsuki A,et al.IL-17 plays an important role In the developiment of experimental autoimmunity encephalomyelitis[J].Immunol,2006,177(1):566-573.

10 朱建建,陈静,黄进华.白介素-23与银屑病的关系[J].国际皮肤性病学杂志,2007,33:177-179.

11 Gawa A,Andoh A,Araki Y.Neutralization of interleukin-17 aggravatedextran sulfatesodium-induced colitis in mice[J].Clin Immunol,2004,110(1):55-58.

12 Avidson NJ,Leach MW,Fort MM,et al.T helper cell 1-type CD4+T cells,but not B cells,mediate colitis in interleukin-10 deficient mice[J].Exp Med,1996,184:241-225.

13 Ossiez F.Interleukin-17[J].Int Rev Immunol,1998,16:541-551.

14 欧阳钦.炎症性肠病的研究策略[J].中华消化杂志,2005,35:385-386.

15 李文波,孙自勤.溃疡性结肠炎治疗药物现状[J].中国临床医学,2004,11(2):144-147.