基于均匀设计法优化紫肉甘薯高效快繁体系

顾地周 ，陈林 ，冯颖 ，姜云天

（1.通化师范学院生物系，吉林通化，134002；2.吉林省通化市靖宇中学）

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]具有产量高、稳产性好、抗逆性强、用途广等特点，是我国第四大粮食作物。近年来，随着经济的发展，甘薯的消费转向以加工和鲜薯食用为主，甘薯的科研转向淀粉加工、优质食用、茎叶菜用、特用（高花青素、高胡萝卜素、无β-淀粉酶）等专用型品种的选育与开发利用为主。紫肉甘薯因富含花青素，具独特的色彩、食用风味及护肝、降血糖、抗癌等保健功效，作为鲜薯食用为人们所青睐，作为原料开发的薯片、薯酱、色素等产品的市场前景广阔。因其常规繁殖时萌芽少，大面积推广栽培和应用受到极大的限制。因此，对其进行离体高效快繁尤为重要。通过愈伤组织再分化芽苗途径具有增殖系数高等优点，但仍存在外植体诱导愈伤组织周期较长、获得不定芽速度较慢，且愈伤组织长期连续增殖极易发生退化和变异等缺点。而相对于愈伤组织再分化芽苗过程，腋芽增殖并同时生根途径不仅成苗速度快，繁殖系数高，而且遗传稳定性强，一步成苗，大大提高了种苗生产效率。同时，应用均匀设计对紫肉甘薯嫩茎的腋芽伸长生长和茎段生根条件进行筛选，以期获得最佳培养条件。目前同属其他种植物的组织培养已有报道[2～3]，但关于紫肉甘薯高效快繁的报道迄今未见。

1 材料与方法

1.1 外植体材料的处理

4月初，采紫肉甘薯嫩茎（引自福建省泉州市农业科学研究所选育的泉紫薯1号品种）在实验室内水培促使腋芽萌发。待腋芽萌发并长至3.0 cm时剪下，在超净工作台上用70%酒精涮洗60 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡8 min，无菌水冲洗10次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切割成一叶一段作为外植体备用[1]。

1.2 紫肉甘薯腋芽萌发生长及茎段生根培养基的筛选

以改良MS（1/4大量元素、1/3微量元素、1/3铁盐和1/3有机成分）为基本培养基，附加蔗糖20 g/L，琼脂粉 8.5 g/L，pH 值 5.7，温度（24±2）℃，光照强度1 100 lx，光照周期10 h/d。待外植体嫩茎段的腋芽萌发长至2.0 cm时，将其切下后切割成一叶一段接种到附加不同浓度的IAA、IBA、NAA和 GA3的改良MS培养基上进行腋芽伸长生长及生根培养，筛选最适宜的培养基。

1.3 高效快繁体系的建立

以节培法进行快繁[2～3]，以紫肉甘薯再生植株的茎节为材料，即切割成一叶一段转接到优化后的腋芽伸长生长及生根培养基中进行节增殖及生根培养。统计计算出增殖周期和倍数。

1.4 数据分析

数据分析与处理采用均匀设计 （Uniform Design）软件。回归分析均采用全回归（后退法）。

2 结果与分析

2.1 改良MS培养基中不同植物生长调节物质浓度交叉配比对紫肉甘薯腋芽生长及茎段生根的影响

待外植体嫩茎段的腋芽萌发后长至2.0 cm时，将其切下后切割成一叶一段转接到附加不同浓度的IAA、IBA、NAA和GA3的改良MS培养基中进行腋芽伸长生长及生根培养，由预试验可知浓度范围分别为 IAA 0.10～0.40 mg/L，IBA 0.10～0.30 mg/L，NAA 0.07～0.12 mg/L 和 GA31.10～1.80 mg/L， 低于控制范围的植物生长调节物质不能促使紫肉甘薯生根和腋芽伸长生长；过高的植物生长调节物质导致幼苗基部膨胀或产生愈伤瘤和抑制腋芽萌发生长，继续培养根从膨胀部或愈伤瘤上发出，这样的苗在移栽时，根随愈伤瘤从苗基部脱落，移栽成活率几乎为零，可能是根与苗茎的纤维疏导组织连接不完整所致。为了提高紫肉甘薯植株再生的速度和再生率，采用均匀设计法[4～6]，每个处理 30株，选用U10（104）均匀表（表 1），同时考察了 IAA、IBA、NAA和GA3浓度交叉配比对紫肉甘薯腋芽伸长生长及生根的影响，考察再生率以腋芽伸长生长和茎段生根为标准，结果见表2。

所得数据经均匀设计软件处理，得回归方程Y=120-97.9X1+17.5X2-10.0X3-13.1X4，样本容量 N=10，显著性水平 α=0.01，复相关系数 R=0.999 1，检验值 Ft=720.9，临界值 F（0.01，4，5）=11.39，Ft＞F（0.01，4，5），显著，说明回归方程有意义。对各方程项进行显著性检 验 可 知 ： 检 验 值 F（3）=0.671 6， 临 界 值 F（0.01，1，5）=16.26，F（3）≤F（0.01，1，5），此方程项不显著,需要剔除。剔除不显著方程项，新建回归方程继续计算:得回归方程Y=119-98.1X1+18.3X2-13.0X4，复相关系数R=0.999 0，检验值 Ft=1 017，临界值 F（0.01，3，6）=9.780，Ft＞F（0.01，3，6），回归方程显著。 同理对各方程项进行显著性检验可知：各方程项对Y影响均显著。根据回归方程求出 Y的最优组合为：X1=0.10，X2=0.30，X4=1.10，在此组合基础上求得最优解：y=100，此解为方程解析解，需按公式Y=y±Uα·s计算出优化值区间估计为 Y=100±2.00，即 98.0%～102.0%。以最优组合做试验验证，将紫肉甘薯嫩茎段接种到附加IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L的改良MS培养基中，培养10 d嫩茎基部开始出现根锥，18 d后腋芽开始萌动生长，继续培养至23 d嫩茎基部直接发出3～5条不定根（图1a），28 d后苗高可达3.0 cm以上，有的产生了侧根，根和苗的形态、发育均正常，再生率达99.5%以上。在估计区间范围内，且比所有试验Y值都大。可见，紫肉甘薯腋芽萌发生长及生根的最佳培养基为：MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L。

表1 U10(104)因素及水平设计 mg/L

表 2 U10(104)均匀设计实验安排及结果

2.2 高效快繁体系的建立

采取节培法进行继代快繁，待紫肉甘薯茎段生根的苗伸长至5.0 cm以上时，在超净台上打开培养瓶留一叶剪下苗干，将其切割成一叶一段再转接到嫩茎段生根同时腋芽伸长生长的培养基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L中进行节增殖和生根培养。21 d为1个增殖周期，每瓶增殖倍数平均达50以上（图1b）。

图1 紫肉甘薯组培图（a为外植体茎断的初代培养；b为腋芽增殖及生根；c为移栽。）

2.3 炼苗和移栽

待苗根长至3.0 cm以上时，从培养瓶中取出试管苗，在含有3 mg/L杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经20倍杀毒矾消毒过的腐烂松针、泥炭土和细河砂（2∶1∶1）混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在80%，温度控制在（20±2）℃，每天自然光照8 h，每天中午通风换气15 min，7 d后揭去薄膜，每天早晚喷洒清水各1次，成活率达98%以上（图1c）。

3 结论与讨论

试验结果表明，培养基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L对紫肉甘薯腋芽伸长生长及茎段生根的诱导效果显著，IAA和IBA的同时加入促进了茎段的生根率和生根速度，在培养基中添加1.10 mg/L的GA3促进了腋芽的萌发和伸长生长；继代快繁采取节培法，以紫肉甘薯再生植株的茎节为材料，即切割成一叶一段转接到优化后的腋芽伸长生长及生根培养基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L中进行节增殖和生根培养，遗传稳定性好，速度快、成苗率高，从而缩短了增殖周期，提高了增殖倍数，方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了快速增殖的目的。应用均匀设计法处理和分析数据大大缩短了培养基配方的摸索周期。本研究已成功建立了紫肉甘薯的高效离体快繁体系，达到了预期目的；这可能对紫肉甘薯品种（系）的生产及工厂化育苗有一定的参考意义。

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